Evaluación de harina de amaranto como ingrediente antioxidante para la preparación de matrices alimentarias funcionales

La evidencia científica respalda el vínculo entre los desequilibrios redox y la génesis de muchas enfermedades crónicas no transmisibles. La incorporación dietaria de sustancias capaces de mejorar los mecanismos de defensa antioxidante del organismo tiene potencial para prevenir o limitar la graveda...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal: Rodríguez, Mariela
Otros Autores: Tironi, Valeria Anahí
Formato: Tesis Tesis de doctorado
Lenguaje:Español
Publicado: 2022
Materias:
Biología
Proteínas
Péptidos
Compuestos fenólicos
Amaranto
Antioxidantes
Acceso en línea:http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/162211
https://doi.org/10.35537/10915/162211
Aporte de:
SEDICI (UNLP) de Universidad Nacional de La Plata
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En el estudio de los componentes de naturaleza proteica se evaluó contenido total de proteína, solubilidad y tamaños de los péptidos-polipéptidos mediante electroforesis y FPLC (cromatografía de filtración en gel de compuestos hidrosolubles) colectando fracciones. En el análisis de compuestos fenólicos fueron utilizados diferentes protocolos de extracción. Se determinó el contenido de polifenoles totales (método de Folin-Ciocalteau) y la composición (RP-HPLC/espectros UV) de los extractos. 2) Simulación de la digestión gastrointestinal. Luego de ser ingeridos proteínas y polifenoles experimentan modificaciones durante el pasaje a través del tracto gastrointestinal que alteran su biofuncionalidad, así como su capacidad para ser absorbidos determinando si ejercen un efecto sistémico o su impacto será local ejerciendo su actividad a nivel intestinal. En este sentido para indagar en los posibles efectos de liberación/modificación enzimática se ensayaron diferentes métodos de digestión estática in vitro. Se evaluó el efecto de las condiciones simuladas de digestión gastrointestinal (DGIS) y la matriz sobre la hidrólisis de proteínas, la generación de péptidos antioxidantes, y la liberación de polifenoles conjugados. Se analizó el grado de hidrólisis proteica (TNBS), la composición peptídica y de compuestos fenólicos en los digeridos obtenidos. 3) Evaluación de la actividad antioxidante in vitro acelular. Se evaluó la actividad antioxidante en extractos acuosos (ORAC, HORAC) y orgánicos (ORAC, ABTS) de las matrices de partida y en las muestras digeridas. 4) Evaluación de la actividad antioxidante in vitro celular. Se evaluó la actividad antioxidante sobre el modelo celular Caco-2 TC7 de fracciones obtenidas de los digeridos presumiblemente enriquecidas en compuestos fenólicos, péptidos y en fracciones de diferentes MM .Inicialmente se evaluó viabilidad y se registró una elevada citotoxicidad en las fracciones acuosas de los digeridos asociada a los reactivos de digestión, especialmente las sales biliares; para superar este inconveniente se aplicaron tratamientos para generar la eliminación/reducción de estas. A continuación, se determinaron ROS intracelulares en células pretratadas con la muestra y se midieron las actividades de superóxido dismutasa (SOD) y Glutatión peroxidasa (GPx) en lisados celulares expuestos secuencialmente a fracciones potencialmente bioactivas y luego a H2O2. En H, se pudo profundizar realizando un estudio in vivo (capítulo II), que permitió analizar la bioactividad en un modelo animal. Se evaluó el efecto de incorporar H durante dos períodos y en dos dosis diferentes en dietas altas en grasas (DAG) administradas a ratas, sobre el estado oxidativo sistémico y de la pared intestinal. Adicionalmente se compararon los efectos registrados cuando el ingrediente incorporado fue aislado proteico de amaranto (A). Posterior al sacrificio de los animales se llevó a cabo la evaluación del estrés oxidativo mediante la determinación de las actividades de SOD y GPx, la presencia de malondialdehído y contenido de GSH reducido. Los resultados obtenidos posicionan a H como una fuente de componentes antioxidantes con potencial efecto beneficioso para la salud intestinal del consumidor. Asimismo, los dos tipos de productos estudiados, B y P, presentan potencialidad para ser considerados a futuro como alimentos funcionales antioxidantes. En todos los casos, se registró una potencial acción antioxidante de los componentes presentes luego de la DGIS de las diferentes matrices y que podría ser ejercida sobre la pared intestinal. Las tres variables evaluadas en el estudio in vivo; matriz, dosis y tiempo de consumo influyeron en parámetros relacionados con el estado antioxidante en el intestino y el hígado. H y A mostraron potencial para regular el equilibrio redox, particularmente en los casos en los que el 50 % de la proteína de la dieta había sido reemplazada por proteína de amaranto. Los aumentos en las actividades enzimáticas en los cultivos celulares Caco-2 TC7 tratados con las fracciones del digerido de harina se correspondieron con los aumentos en dichas actividades enzimáticas en intestino/colon de ratas logrados luego de un consumo de la DAG con un reemplazo del 50 % de proteína por proteína de H. Estos hallazgos constituyen un primer indicio de corroboración de efectos in vivo que abren el camino para continuar estos estudios, perfeccionando los modelos utilizados y sumando aspectos/procesos y biomarcadores a evaluar.
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En este contexto, se planteó como objetivo general del presente trabajo, evaluar a la harina de amaranto (H) como un ingrediente funcional antioxidante utilizado en la preparación de un producto bebible (B) y de productos panificados (P) con la potencialidad de ser alimentos fuente de compuestos con acción preventiva del estrés oxidativo. La metodología empleada para el análisis de los compuestos bioactivos en las matrices de partida: Harina (capítulo I), Bebida a base de amaranto (capítulo III) y Panes (capítulo IV), se estructuró en cuatro etapas generales: 1) Aislamiento, cuantificación e identificación de los compuestos bioactivos. En el estudio de los componentes de naturaleza proteica se evaluó contenido total de proteína, solubilidad y tamaños de los péptidos-polipéptidos mediante electroforesis y FPLC (cromatografía de filtración en gel de compuestos hidrosolubles) colectando fracciones. En el análisis de compuestos fenólicos fueron utilizados diferentes protocolos de extracción. Se determinó el contenido de polifenoles totales (método de Folin-Ciocalteau) y la composición (RP-HPLC/espectros UV) de los extractos. 2) Simulación de la digestión gastrointestinal. Luego de ser ingeridos proteínas y polifenoles experimentan modificaciones durante el pasaje a través del tracto gastrointestinal que alteran su biofuncionalidad, así como su capacidad para ser absorbidos determinando si ejercen un efecto sistémico o su impacto será local ejerciendo su actividad a nivel intestinal. En este sentido para indagar en los posibles efectos de liberación/modificación enzimática se ensayaron diferentes métodos de digestión estática in vitro. Se evaluó el efecto de las condiciones simuladas de digestión gastrointestinal (DGIS) y la matriz sobre la hidrólisis de proteínas, la generación de péptidos antioxidantes, y la liberación de polifenoles conjugados. Se analizó el grado de hidrólisis proteica (TNBS), la composición peptídica y de compuestos fenólicos en los digeridos obtenidos. 3) Evaluación de la actividad antioxidante in vitro acelular. Se evaluó la actividad antioxidante en extractos acuosos (ORAC, HORAC) y orgánicos (ORAC, ABTS) de las matrices de partida y en las muestras digeridas. 4) Evaluación de la actividad antioxidante in vitro celular. Se evaluó la actividad antioxidante sobre el modelo celular Caco-2 TC7 de fracciones obtenidas de los digeridos presumiblemente enriquecidas en compuestos fenólicos, péptidos y en fracciones de diferentes MM .Inicialmente se evaluó viabilidad y se registró una elevada citotoxicidad en las fracciones acuosas de los digeridos asociada a los reactivos de digestión, especialmente las sales biliares; para superar este inconveniente se aplicaron tratamientos para generar la eliminación/reducción de estas. A continuación, se determinaron ROS intracelulares en células pretratadas con la muestra y se midieron las actividades de superóxido dismutasa (SOD) y Glutatión peroxidasa (GPx) en lisados celulares expuestos secuencialmente a fracciones potencialmente bioactivas y luego a H2O2. En H, se pudo profundizar realizando un estudio in vivo (capítulo II), que permitió analizar la bioactividad en un modelo animal. Se evaluó el efecto de incorporar H durante dos períodos y en dos dosis diferentes en dietas altas en grasas (DAG) administradas a ratas, sobre el estado oxidativo sistémico y de la pared intestinal. Adicionalmente se compararon los efectos registrados cuando el ingrediente incorporado fue aislado proteico de amaranto (A). Posterior al sacrificio de los animales se llevó a cabo la evaluación del estrés oxidativo mediante la determinación de las actividades de SOD y GPx, la presencia de malondialdehído y contenido de GSH reducido. Los resultados obtenidos posicionan a H como una fuente de componentes antioxidantes con potencial efecto beneficioso para la salud intestinal del consumidor. Asimismo, los dos tipos de productos estudiados, B y P, presentan potencialidad para ser considerados a futuro como alimentos funcionales antioxidantes. En todos los casos, se registró una potencial acción antioxidante de los componentes presentes luego de la DGIS de las diferentes matrices y que podría ser ejercida sobre la pared intestinal. Las tres variables evaluadas en el estudio in vivo; matriz, dosis y tiempo de consumo influyeron en parámetros relacionados con el estado antioxidante en el intestino y el hígado. H y A mostraron potencial para regular el equilibrio redox, particularmente en los casos en los que el 50 % de la proteína de la dieta había sido reemplazada por proteína de amaranto. Los aumentos en las actividades enzimáticas en los cultivos celulares Caco-2 TC7 tratados con las fracciones del digerido de harina se correspondieron con los aumentos en dichas actividades enzimáticas en intestino/colon de ratas logrados luego de un consumo de la DAG con un reemplazo del 50 % de proteína por proteína de H. Estos hallazgos constituyen un primer indicio de corroboración de efectos in vivo que abren el camino para continuar estos estudios, perfeccionando los modelos utilizados y sumando aspectos/procesos y biomarcadores a evaluar. Scientific evidence supports the link between redox imbalances and the genesis of many chronic non-communicable diseases. The dietary incorporation of substances capable of improving the body's antioxidant defence mechanisms has the potential to prevent or limit the severity of this type of disease. In this context, the general objective of this study was to evaluate amaranth flour as a functional antioxidant ingredient used in the preparation of a beverage and bakery products with the potential to be a food source of compounds with preventive action against oxidative stress. The methodology used for the analysis of bioactive compounds in the starting matrices: Flour (chapter I), Amaranth-based beverage (chapter III) and Breads (chapter IV), was structured in four general stages: 1) Isolation, quantification, and identification of bioactive compounds. In the study of the protein components, total protein content, solubility and sizes of the peptide-polypeptides were evaluated by electrophoresis and FPLC (water-soluble compounds gel filtration chromatography) collecting fractions. Different extraction protocols were used for the analysis of phenolic compounds. The total polyphenol content (Folin-Ciocalteau method) and the composition (RP-HPLC/UV spectra) of the extracts were determined. 2) Simulation of gastrointestinal digestion. After being ingested, proteins and polyphenols undergo modifications during their passage through the gastrointestinal tract that alter their bifunctionality, as well as their ability to be absorbed, determining whether they exert a systemic effect or their impact will be local, exerting their activity at the intestinal level. To investigate possible enzyme release/modification effects, different in vitro static digestion methods were tested. The effect of simulated gastrointestinal digestion conditions (SGID) and matrix on protein hydrolysis, generation of antioxidant peptides, and release of conjugated polyphenols was evaluated. The degree of protein hydrolysis (TNBS), peptide and phenolic compounds composition in the digests obtained were analysed. 3) Evaluation of acellular in vitro antioxidant activity. Antioxidant activity was evaluated in aqueous (ORAC, HORAC) and organic (ORAC, ABTS) extracts of the starting matrices and in the digested samples. 4) Evaluation of in vitro cellular antioxidant activity. Antioxidant activity was evaluated on the Caco-2 TC7 cell model of fractions obtained from the digests presumably enriched in phenolic compounds, peptides and in fractions of different MM. Initially, viability was evaluated, and high cytotoxicity was recorded in the digests aqueous fractions associated with the digestion reagents, especially bile salts; to overcome this disadvantage, treatments were applied to generate the elimination/reduction of these salts. Then, intracellular ROS were determined in cells pre-treated with the sample and superoxide dismutase (SOD) and Glutathione peroxidase (GPx) activities were measured in cell lysates sequentially exposed to potentially bioactive fractions and then to H2O2. In the flour, an in vivo study (chapter II) was carried out to analyse bioactivity in an animal model. The effect of incorporating flour for two periods and at two different doses in high-fat diets (HFD) administered to rats on systemic and intestinal wall oxidative status was evaluated. Additionally, the effects were compared when the incorporated ingredient was amaranth protein isolate. After the animals were slaughtered, oxidative stress was assessed by determining SOD and GPx activities, the presence of malondialdehyde and reduced GSH content. The results obtained position the amaranth flour as a source of antioxidant components with potential beneficial effect on the intestinal health of the consumer. Likewise, the two types of products studied, beverage and breads, have the potential to be considered as antioxidant functional foods in the future. In all cases, a potential antioxidant action of the components present after the SGID of the different matrices was recorded, which could be exerted on the intestinal wall. All three variables assessed in the in vivo study; matrix, dose and time of consumption influenced parameters related to antioxidant status in the gut and liver. Flour and protein isolate showed potential to regulate redox balance, particularly in cases where 50% of the dietary protein had been replaced by amaranth protein. The increases in enzyme activities in Caco-2 TC7 cell cultures treated with the flour digest fractions corresponded with the increases in enzyme activities in rat intestine/colon achieved after consumption of the HFD with 50% protein replacement by flour protein. These findings constitute a first clue of corroborating in vivo effects that open the way to continue these studies, refining the models used and adding aspects/processes and biomarkers to be evaluated. Doctor en Ciencias Exactas, área Ciencias Biológicas Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Exactas Tesis Tesis de doctorado http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International (CC BY-NC-ND 4.0) application/pdf

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