Rol de la señalización mediada por AMPc en el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi y en célula hospedadora durante la invasión

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La Enfermedad de Chagas, causada por el protozoario flagelar Trypanosoma cruzi, es considerada por el Ministerio de Salud de la Nación Argentina como uno de los principales problemas de salud pública del país. Sin embargo, no existen vacunas contra el parásito y los fármacos de primera línea, nifurt...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Ferri, Gabriel
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2022
Materias:
T.CRUZI
INVASION
AMPC
EPAC
RAP1B
CRATAEGUS
PLANTAS MEDICINALES
ERK
CARP
T. CRUZI
CAMP
RAP 1B
MEDICINAL PLANTS
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7068_Ferri
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La Enfermedad de Chagas, causada por el protozoario flagelar Trypanosoma cruzi, es considerada por el Ministerio de Salud de la Nación Argentina como uno de los principales problemas de salud pública del país. Sin embargo, no existen vacunas contra el parásito y los fármacos de primera línea, nifurtimox (Nfx) y benznidazole (Bnz), presentan alta toxicidad y baja eficiencia, especialmente en la fase crónica de la enfermedad. El desarrollo de drogas tripanocidas más eficientes requiere de la identificación de nuevos blancos moleculares, siendo un buen blanco terapéutico aquel que tenga una función exclusiva y/o esencial en la biología del parásito. En este sentido, las vías de señalización mediadas por AMP cíclico (AMPc), que demostraron ser esenciales en la biología del parásito, podrían representar potenciales blancos moleculares para el desarrollo de nuevos medicamentos en el tratamiento efectivo de la enfermedad de Chagas. En este trabajo se estudiaron dos aspectos fundamentales de la señalización mediada por AMPc. En primer lugar, se identificaron y caracterizaron los efectores del AMPc del hospedador mamífero que participan en la invasión de T. cruzi, y se evaluaron como potenciales blancos terapéuticos. En segunda instancia, se estudiaron in vivo e in vitro las recientemente descubiertas proteínas de respuesta al AMPc (CARP), una familia de proteínas esenciales implicadas en la señalización de este nucleótido en el parásito. En la primera parte se corroboró, en diferentes líneas celulares, que la activación de Epac era necesaria durante la invasión mediada por AMPc. Además, mediante experimentos de precipitación diferencial, se demostró la participación del efector activo de la vía AMPc/Epac, Rap1b-GTP. En línea con estos resultados, la invasión celular y el número de tripomastigotes liberados luego de la invasión aumentaron significativamente en células que expresaban la mutante constitutivamente activa de Rap1b (Rap1b-G12V). Asimismo, los datos obtenidos sugieren que la fosforilación de Rap1b en la S179 tendría un efecto antagonista dependiente de PKA sobre la invasión mediada por AMPc. Con el fin de dilucidar las vías activadas río abajo de AMPc/Epac/Rap1b, se observó que durante el proceso de invasión de la célula hospedadora ocurría la activación, de manera independiente de PKC, de la vía MEK, y la consecuente inducción de la fosforilación de ERK. Al final de este capítulo, se evaluó la inhibición de la vía AMPc/Epac/Rap1b como potencial tratamiento contra la enfermedad de Chagas utilizando un extracto hidroalcohólico de Crataegus oxyacantha (CO-EE), una planta utilizada en medicina alternativa. Nuestros resultados sugieren que CO-EE otorga protección frente a la invasión de T. cruzi a través de la inhibición de la vía de señalización Epac/Rap1b. En este contexto, al utilizar CO-EE en células tratadas o no con Nfx, se observó una adición de los efectos inhibitorios de ambos tratamientos, abriendo la posibilidad de utilizar este extracto en conjunto con las drogas administradas actualmente. En la segunda parte de este trabajo se realizó una validación funcional de CARP1 utilizando epimastigotes transgénicos que sobreexpresan esta proteína. Estos parásitos transgénicos no mostraron diferencias en el crecimiento en comparación con los parásitos de tipo salvaje, incluso en presencia de un análogo de AMPc (8-Br- AMPc). Curiosamente, presentaron una resistencia al estrés oxidativo alrededor de 2.6 veces menor respecto al control. Además, se observó que en los estadíos epimastigote existe una co-localización de la proteína CARP1 con vesículas ácidas, aunque su localización mayoritaria sería citoplasmática. Por último, se logró expresar y purificar los cuatro integrantes de la familia CARP en bacterias, con el fin de realizar una futura caracterización estructural de las mismas.
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El desarrollo de drogas tripanocidas más eficientes requiere de la identificación de nuevos blancos moleculares, siendo un buen blanco terapéutico aquel que tenga una función exclusiva y/o esencial en la biología del parásito. En este sentido, las vías de señalización mediadas por AMP cíclico (AMPc), que demostraron ser esenciales en la biología del parásito, podrían representar potenciales blancos moleculares para el desarrollo de nuevos medicamentos en el tratamiento efectivo de la enfermedad de Chagas. En este trabajo se estudiaron dos aspectos fundamentales de la señalización mediada por AMPc. En primer lugar, se identificaron y caracterizaron los efectores del AMPc del hospedador mamífero que participan en la invasión de T. cruzi, y se evaluaron como potenciales blancos terapéuticos. En segunda instancia, se estudiaron in vivo e in vitro las recientemente descubiertas proteínas de respuesta al AMPc (CARP), una familia de proteínas esenciales implicadas en la señalización de este nucleótido en el parásito. En la primera parte se corroboró, en diferentes líneas celulares, que la activación de Epac era necesaria durante la invasión mediada por AMPc. Además, mediante experimentos de precipitación diferencial, se demostró la participación del efector activo de la vía AMPc/Epac, Rap1b-GTP. En línea con estos resultados, la invasión celular y el número de tripomastigotes liberados luego de la invasión aumentaron significativamente en células que expresaban la mutante constitutivamente activa de Rap1b (Rap1b-G12V). Asimismo, los datos obtenidos sugieren que la fosforilación de Rap1b en la S179 tendría un efecto antagonista dependiente de PKA sobre la invasión mediada por AMPc. Con el fin de dilucidar las vías activadas río abajo de AMPc/Epac/Rap1b, se observó que durante el proceso de invasión de la célula hospedadora ocurría la activación, de manera independiente de PKC, de la vía MEK, y la consecuente inducción de la fosforilación de ERK. Al final de este capítulo, se evaluó la inhibición de la vía AMPc/Epac/Rap1b como potencial tratamiento contra la enfermedad de Chagas utilizando un extracto hidroalcohólico de Crataegus oxyacantha (CO-EE), una planta utilizada en medicina alternativa. Nuestros resultados sugieren que CO-EE otorga protección frente a la invasión de T. cruzi a través de la inhibición de la vía de señalización Epac/Rap1b. En este contexto, al utilizar CO-EE en células tratadas o no con Nfx, se observó una adición de los efectos inhibitorios de ambos tratamientos, abriendo la posibilidad de utilizar este extracto en conjunto con las drogas administradas actualmente. En la segunda parte de este trabajo se realizó una validación funcional de CARP1 utilizando epimastigotes transgénicos que sobreexpresan esta proteína. Estos parásitos transgénicos no mostraron diferencias en el crecimiento en comparación con los parásitos de tipo salvaje, incluso en presencia de un análogo de AMPc (8-Br- AMPc). Curiosamente, presentaron una resistencia al estrés oxidativo alrededor de 2.6 veces menor respecto al control. Además, se observó que en los estadíos epimastigote existe una co-localización de la proteína CARP1 con vesículas ácidas, aunque su localización mayoritaria sería citoplasmática. Por último, se logró expresar y purificar los cuatro integrantes de la familia CARP en bacterias, con el fin de realizar una futura caracterización estructural de las mismas. Chagas disease, caused by the flagellar protozoan Trypanosoma cruzi, is considered by the Argentinian Ministry of Health as one of the main public health problems in the country. However, there is no vaccine against the parasite and the first-line drugs, nifurtimox and benznidazole, present high toxicity and low efficiency, especially during the chronic phase of the disease. The development of more efficient trypanocidal drugs requires the identification of new molecular targets, being excellent therapeutic targets those with exclusive/essential functions in parasite biology. So, cyclic AMP (cAMP) signaling pathways, that shown to be essential in parasite biology, could represent key molecular targets in the development of new drugs for effective treatment against Chagas disease. In this thesis, two fundamental aspects of cAMP-mediated signaling were studied. First, host cAMP effectors involved during the Trypanosoma cruzi invasion were identified, characterized, and evaluated as potential drug targets. Second, the recently discovered cAMP response proteins (CARPs), a family of essential proteins involved in cAMP signalling in the parasite, were studied in vivo and in vitro. In the first part of this work, it was confirmed that Epac activation was necessary during the cAMP-mediated invasion in different cell lines. In addition, the participation of a key member of the cAMP/Epac pathway, Rap1b-GTP, was established by pull-down assays. In line with these results, cell invasion and trypomastigote-release significantly increased in cells expressing the constitutively active mutant form of Rap1b (G12V). Moreover, the results suggested that phosphorylation of Rap1b in the S179 would have a PKA-dependent antagonistic effect over the cAMP-mediated invasion. To elucidate activated signalling pathways downstream cAMP/Epac/Rap1b, we observed that, during host cell invasion, PLC-independent MEK activation occurs with the consequent induction of ERK phosphorylation. At the end of this chapter, the cAMP/Epac/Rap1b pathway inhibition was evaluated as a potential treatment against Chagas disease using a hydroalcoholic extract of Crataegus oxyacantha (CO-EE), a plant used in alternative medicine. Our results suggested that CO-EE provides protection to T. cruzi invasion through the inhibition of Epac/Rap1b pathway. In this context, when CO-EE was used in cells treated or not with Nfx, an addition of the inhibitory effects of both treatments was seen, opening the possibility of testing this extract in conjunction with the drugs currently administrated. In the second part of the work, a functional validation of CARP1 was done using transgenic epimastigotes overexpressing this protein. These transgenic parasites did not show differences in growth compared to wild-type parasites, even when treated with the cAMP analog 8-Br-cAMP. Interestingly, these parasites showed 2.6 times less resistance to oxidative stress than the control. Also, we found that there is a colocalization of CARP1 protein with acid vesicles in epimastigote stages, although the subcellular location of CARP1 is mostly cytoplasmatic. Finally, expression and purification of the four members of the CARP family in bacteria was completed in order to carry out a future structural characterization of them. Fil: Ferri, Gabriel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2022 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7068_Ferri

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