Construcción y caracterización de un microscopio light sheet para el estudio del desarrollo embrionario a nivel molecular

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En este trabajo se diseñó y construyó un microscopio multilínea basado en la técnica de light sheet fluorescence microscopy (LSFM) para cuantificar observables morfológicos y moleculares en organismos durante el desarrollo embrionario. Esta técnica se basa en la generación de planos de luz muy finos...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Moretti, Bruno
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2020
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6768_Moretti
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description En este trabajo se diseñó y construyó un microscopio multilínea basado en la técnica de light sheet fluorescence microscopy (LSFM) para cuantificar observables morfológicos y moleculares en organismos durante el desarrollo embrionario. Esta técnica se basa en la generación de planos de luz muy finos para obtener seccionamiento óptico, uno de los requisitos fundamentales para poder observar muestras en tres dimensiones. Por su configuración óptica, los microscopios LSFM se caracterizan por alcanzar velocidades de adquisición mucho más rápidas que las técnicas clásicas de barrido como la microscopía confocal, con niveles de daño biológico mucho más bajos y la posibilidad de hacer adquisiciones desde varios puntos de vista. Esto hace que la técnica sea ideal para el estudio de organismos vivos durante tiempos largos. El microscopio construido consiste de una etapa de combinación de láseres de distintas longitudes de onda, una etapa de iluminación y otra de detección. En la primera se acoplan tres láseres a una fibra óptica monomodo con el objetivo de filtrar espacialmente el haz y lograr mayor estabilidad mecánica. En la etapa de iluminación se utiliza una lente cilíndrica para generar un plano de luz, que es enfocado sobre una muestra fluorescente utilizando un objetivo de microscopio. En la detección, un segundo objetivo (ortogonal al de iluminación) colecta la fluorescencia emitida por la muestra. Esta fluorescencia es enfocada en el sensor de una cámara sCMOS mediante una lente de tubo. Se desarrolló un software en Python que a través de una interfaz gráfica permite controlar todos los componentes del microscopio y automatizar experimentos de manera flexible. Para validar la versatilidad del microscopio, se observaron embriones vivos de distintos organismos. Se realizó una serie temporal del desarrollo de un embrión de pez Medaka desde un estadío de cuatro células y durante 24 horas. Se registró la dinámica del latido cardíaco de un embrión de pez Medaka con una resolución temporal de 50 ms. Se observó el desarrollo de embriones de moscas de la fruta desde dos puntos de vista desde algunas horas después de la fertilización hasta la formación de larvas. Se utilizó el microscopio construido para estudiar el proceso de gastrulación de embriones de Xenopus laevis, en el que un grupo de células migran e ingresan en el labio dorsal del blastoporo. Esto se realizó en colaboración con el grupo de la Dra. María Cecilia Cirio (IFIBYNE - CONICET). Dada la profundidad a la que ocurren estos fenómenos, esta información no hubiera sido posible de obtener utilizando microscopía confocal. Se tomaron stacks tridimensionales de imágenes de estos procesos migratorios y se segmentaron y siguieron a través del tiempo células individuales durante tiempos del orden de seis horas. Este gran volumen de datos fue analizado utilizando algoritmos de diseño propio en Python para cuantificar descriptores morfológicos y velocimétricos del organismo durante el proceso observado. Esto se realizó para embriones en los que se indujo una pérdida de función de la proteína Furry y en embriones control. A partir del seguimiento de células individuales a través del tiempo fue posible determinar que en estos embriones las células migran con menor velocidad y persistencia que en embriones control. Se desarrolló un método basado en triangulaciones de Delaunay para estimar la distancia entre células vecinas a partir de la distancia entre los núcleos celulares. Esto mostró que se produce una acumulación de células cerca del labio dorsal del blastoporo en embriones con pérdida de función de Furry. Con el objetivo de cuantificar la actividad molecular de observables biológicos, se le agregó al microscopio la capacidad de hacer mediciones de anisotropía de polarización para determinar el estado de biosensores. Esta técnica se utilizó para hacer las primeras mediciones de una nueva línea transgénica de moscas de la fruta que expresa un sensor de homoFRET de actividad de caspasas. Las caspasas son una familia de proteasas que tiene un rol clave en el correcto funcionamiento de la muerte celular programada. El sensor consta de dos fluoróforos iguales unidos por una secuencia que la caspasa Drice reconoce como sitio de clivaje. Como consecuencia, cuando una célula entra en estado apoptótico y produce Drice, el sensor se cliva. Esto resulta en un cambio en la polarización de la fluorescencia de emisión. Para poder detectar dicho cambio, se agregó un OptoSplit en el camino de detección. Este dispositivo permite dividir la imagen en dos e introducir elementos ópticos (en este caso polarizadores) en cada camino. También se ensayó el uso de una rueda doble de filtros de fluorescencia y polarización. Para analizar las imágenes resultantes, se escribió un algoritmo que permite elegir áreas correspondientes a las imágenes de cada polarización. Una vez hecho esto, el software alinea las imágenes y calcula las imágenes de anisotropía. Se agregó al microscopio un LED ultravioleta que permite irradiar muestras para inducir muerte celular. Se realizó un experimento piloto irradiando embriones de la línea transgénica generada, en los que se detectó un aumento global en la anisotropía luego de la irradiación. En conclusión, se diseñó y construyó un microscopio LSFM con capacidad de estudiar cuantitativamente observables biológicos fenotípicos y moleculares en distintos organismos. Según nuestro conocimiento, este es el único microscopio LSFM disponible en el país. Se desarrolló un software propio de control y automatización de experimentos, así como también algoritmos de análisis de grandes volúmenes de datos. Utilizando estas herramientas, se estudió el proceso de gastrulación de Xenopus laevis, encontrándose que en los embriones con pérdida de función de la proteína Furry las células migran con menor velocidad y persistencia, y presentan un agrupamiento cerca del labio dorsal que no se observa en embriones control. Se le agregó al microscopio la capacidad de hacer mediciones de homoFRET por anisotropía de polarización y se realizaron las primeras mediciones de actividad de la caspasa Drice en embriones vivos de moscas de la fruta.
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Por su configuración óptica, los microscopios LSFM se caracterizan por alcanzar velocidades de adquisición mucho más rápidas que las técnicas clásicas de barrido como la microscopía confocal, con niveles de daño biológico mucho más bajos y la posibilidad de hacer adquisiciones desde varios puntos de vista. Esto hace que la técnica sea ideal para el estudio de organismos vivos durante tiempos largos. El microscopio construido consiste de una etapa de combinación de láseres de distintas longitudes de onda, una etapa de iluminación y otra de detección. En la primera se acoplan tres láseres a una fibra óptica monomodo con el objetivo de filtrar espacialmente el haz y lograr mayor estabilidad mecánica. En la etapa de iluminación se utiliza una lente cilíndrica para generar un plano de luz, que es enfocado sobre una muestra fluorescente utilizando un objetivo de microscopio. En la detección, un segundo objetivo (ortogonal al de iluminación) colecta la fluorescencia emitida por la muestra. Esta fluorescencia es enfocada en el sensor de una cámara sCMOS mediante una lente de tubo. Se desarrolló un software en Python que a través de una interfaz gráfica permite controlar todos los componentes del microscopio y automatizar experimentos de manera flexible. Para validar la versatilidad del microscopio, se observaron embriones vivos de distintos organismos. Se realizó una serie temporal del desarrollo de un embrión de pez Medaka desde un estadío de cuatro células y durante 24 horas. Se registró la dinámica del latido cardíaco de un embrión de pez Medaka con una resolución temporal de 50 ms. Se observó el desarrollo de embriones de moscas de la fruta desde dos puntos de vista desde algunas horas después de la fertilización hasta la formación de larvas. Se utilizó el microscopio construido para estudiar el proceso de gastrulación de embriones de Xenopus laevis, en el que un grupo de células migran e ingresan en el labio dorsal del blastoporo. Esto se realizó en colaboración con el grupo de la Dra. María Cecilia Cirio (IFIBYNE - CONICET). Dada la profundidad a la que ocurren estos fenómenos, esta información no hubiera sido posible de obtener utilizando microscopía confocal. Se tomaron stacks tridimensionales de imágenes de estos procesos migratorios y se segmentaron y siguieron a través del tiempo células individuales durante tiempos del orden de seis horas. Este gran volumen de datos fue analizado utilizando algoritmos de diseño propio en Python para cuantificar descriptores morfológicos y velocimétricos del organismo durante el proceso observado. Esto se realizó para embriones en los que se indujo una pérdida de función de la proteína Furry y en embriones control. A partir del seguimiento de células individuales a través del tiempo fue posible determinar que en estos embriones las células migran con menor velocidad y persistencia que en embriones control. Se desarrolló un método basado en triangulaciones de Delaunay para estimar la distancia entre células vecinas a partir de la distancia entre los núcleos celulares. Esto mostró que se produce una acumulación de células cerca del labio dorsal del blastoporo en embriones con pérdida de función de Furry. Con el objetivo de cuantificar la actividad molecular de observables biológicos, se le agregó al microscopio la capacidad de hacer mediciones de anisotropía de polarización para determinar el estado de biosensores. Esta técnica se utilizó para hacer las primeras mediciones de una nueva línea transgénica de moscas de la fruta que expresa un sensor de homoFRET de actividad de caspasas. Las caspasas son una familia de proteasas que tiene un rol clave en el correcto funcionamiento de la muerte celular programada. El sensor consta de dos fluoróforos iguales unidos por una secuencia que la caspasa Drice reconoce como sitio de clivaje. Como consecuencia, cuando una célula entra en estado apoptótico y produce Drice, el sensor se cliva. Esto resulta en un cambio en la polarización de la fluorescencia de emisión. Para poder detectar dicho cambio, se agregó un OptoSplit en el camino de detección. Este dispositivo permite dividir la imagen en dos e introducir elementos ópticos (en este caso polarizadores) en cada camino. También se ensayó el uso de una rueda doble de filtros de fluorescencia y polarización. Para analizar las imágenes resultantes, se escribió un algoritmo que permite elegir áreas correspondientes a las imágenes de cada polarización. Una vez hecho esto, el software alinea las imágenes y calcula las imágenes de anisotropía. Se agregó al microscopio un LED ultravioleta que permite irradiar muestras para inducir muerte celular. Se realizó un experimento piloto irradiando embriones de la línea transgénica generada, en los que se detectó un aumento global en la anisotropía luego de la irradiación. En conclusión, se diseñó y construyó un microscopio LSFM con capacidad de estudiar cuantitativamente observables biológicos fenotípicos y moleculares en distintos organismos. Según nuestro conocimiento, este es el único microscopio LSFM disponible en el país. Se desarrolló un software propio de control y automatización de experimentos, así como también algoritmos de análisis de grandes volúmenes de datos. Utilizando estas herramientas, se estudió el proceso de gastrulación de Xenopus laevis, encontrándose que en los embriones con pérdida de función de la proteína Furry las células migran con menor velocidad y persistencia, y presentan un agrupamiento cerca del labio dorsal que no se observa en embriones control. Se le agregó al microscopio la capacidad de hacer mediciones de homoFRET por anisotropía de polarización y se realizaron las primeras mediciones de actividad de la caspasa Drice en embriones vivos de moscas de la fruta. In this work, I designed and constructed a microscope based on the light sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique to quantify morphological and molecular observables during embryo development. This technique is based on the generation of very thin sheets of light to obtain optical sectioning, one of the fundamental requirements to observe samples in three dimensions. Given their optical configuration, LSFM microscopes are characterized by achieving acquisition speed much faster than those obtained in classical scanning techniques such as confocal microscopy, with much lower levels of photodamage and the ability to perform multi-view image acquisition. This makes LSFM ideal to study live organisms during long periods of time. The microscope I built consists of a laser combination stage, an illumination stage, and a detection stage. In the first stage, three lasers are coupled into a single-mode optical fiber with the goal of spatially filtering the beam and achieve greater mechanical stability. In the illumination stage, a cylindrical lens is used to generate a sheet of light that is focused on a fluorescent sample using a microscope objective. In the detection stage, a second objective (orthogonal to the illumination one) collects the fluorescence emitted by the sample. This fluorescence is focused on the sensor of an sCMOS camera using a tube lens. I developed a Python software that allows to control all the components of the microscope and automate experiments in a flexible way through a graphical interface. This microscope was used to study the process of gastrulation of Xenopus laevis embryos, in which a group of cells migrate and enter the dorsal blastopore lip. Given the depth at which these phenomena occur, this information would not have been possible to obtain using confocal microscopy. Three-dimensional stacks of images of these migratory processes were taken and individual cells were segmented and followed over times of the order of six hours. This large volume of data was analyzed using custom algorithms in Python to quantify morphological and velocimetric descriptors of the organism during the observed process. This was done for embryos in which a loss of function of the Furry protein was induced and in control embryos. From an analysis of the spatiality of cell nuclei over time, it was found that in embryos that don’t express Furry cells tend to crowd near the dorsal lip. From the tracking of single cells over time it was possible to determine that in these embryos the cells migrate with lower speed and persistence than in control embryos. In order to quantify the molecular activity of biological observables, the ability to make polarization anisotropy measurements to determine the state of biosensors was added to the microscope. This technique was used to make the first measurements of a new transgenic line of fruit flies that expresses a homoFRET sensor of caspases activity. Caspases are a family of proteases that have a key role in the proper functioning of programmed cell death. The sensor consists of two copies of the same fluorophore linked by a sequence that caspase 3 recognizes as a cleavage site. As a consequence, when a cell enters an apoptotic state and produces caspase 3, the sensor becomes cleaved. This results in a change in the polarization of the emission fluorescence. In order to detect this change, an OptoSplit was added to the detection path. This device allows imaging of two different polarizations simultaneously using the same camera. To analyze the resulting images, an algorithm that allows choosing areas corresponding to the images of each polarization was written. Once this is done, the software aligns the images and calculates the anisotropy image. In conclusion, I designed and constructed an LSFM microscope with the ability to quantitatively study phenotypic and molecular biological observables in different organisms. Software for control and automation of experiments was developed, as well as algorithms for analyzing large volumes of data. Using these tools, the gastrulation process of Xenopus laevis was studied, finding that in embryos with loss of function of the Furry protein the cells migrate with less speed and persistence and present a clustering near the dorsal lip that is not observed in control embryos. The ability to make homoFRET measurements by polarization anisotropy was added to the microscope and the first measurements of caspase 3 activity in live fruit fly embryos were made. Fil: Moretti, Bruno. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2020-03 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6768_Moretti

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