Modulación de la activación de receptores muscarínicos M2 por autoanticuerpos séricos de pacientes chagásicos con disautonomía

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Estudios previos han demostrado una fuerte asociación entre la presencia de autoanticuerpos IgG circulantes contra el receptor muscarínico M2 (RM2) y la evidencia de disautonomía cardiovascular, así como una correlación positiva significativa entre los niveles séricos de anticuerpos (Ac) anti-RM2 y...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Beltrame, Sabrina Paola
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2018
Materias:
AUTOANTICUERPOS
RECEPTOR MUSCARINICO M2
CHAGAS
DISAUTONOMIA
ACTIVACION DEL RECEPTOR
SEÑALIZACION
MODULACION ALOSTERICA
AUTOANTIBODIES
M2 MUSCARINIC RECEPTOR
DYSAUTONOMIA
RECEPTOR ACTIVATION
SIGNALING
ALLOSTERIC MODULATION
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6516_Beltrame
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Estudios previos han demostrado una fuerte asociación entre la presencia de autoanticuerpos IgG circulantes contra el receptor muscarínico M2 (RM2) y la evidencia de disautonomía cardiovascular, así como una correlación positiva significativa entre los niveles séricos de anticuerpos (Ac) anti-RM2 y el grado de inhibición vagal, en pacientes chagásicos crónicos. Al unirse al segundo loop extracelular (II-LEC) del RM2, estos Ac activan a su receptor blanco, estimulando vías de señalización acopladas a proteína Gi. Además, los Ac anti-RM2 pueden atenuar el efecto inotrópico negativo de agonistas muscarínicos en la aurícula aislada de rata. Basados en estos antecedentes, postulamos que la exposición de los RM2 a los Ac anti-RM2 podría promover una inhibición de la señalización estimulada por agonista a través de este receptor. Utilizando procedimientos luminométricos basados en la “transferencia de energía bioluminiscente en resonancia” (BRET) y la activación de acuorina en sistemas de expresión heteróloga (células HEK 293T), demostramos que la fracción IgG sérica de pacientes chagásicos con disautonomía (IgG ChD) modula positivamente la interacción RM2/RM2 e inhibe tanto la señalización acoplada a proteína Gi como el reclutamiento de arrestina-2 (Arr-2) al RM2, cuando ambos procesos son estimulados por agonista. Estos efectos no pudieron ser mimetizados ni por la fracción IgG de individuos controles seronegativos para Ac anti-RM2, ni por el fragmento monovalente Fab de la fracción IgG ChD, sugiriendo que los Ac anti-RM2 bivalentes promueven un cambio conformacional en la molécula del RM2 a través de crosslinking de receptores, afectando de esta manera la activación del receptor por el agonista. Dado que IgG ChD no logró promover ni el reclutamiento de Arr-2 al RM2 ni la internalización de este receptor en células HEK 293T, es improbable que los efectos inhibitorios de los Ac anti-RM2 sobre la señalización mediada por RM2 se deban a una regulación homóloga del receptor a corto plazo. Alternativamente, postulamos que estos Ac ejercen un efecto alostérico negativo sobre el RM2 a través de la interacción con el sitio alostérico común, en el II-LEC. En base a estos resultados proponemos que los efectos inhibitorios de los Ac anti-RM2 sobre la señalización estimulada por acetilcolina, a través de la activación de RM2 cardíacos, podrían contribuir a la inhibición de la función vagal en pacientes chagásicos crónicos.
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Al unirse al segundo loop extracelular (II-LEC) del RM2, estos Ac activan a su receptor blanco, estimulando vías de señalización acopladas a proteína Gi. Además, los Ac anti-RM2 pueden atenuar el efecto inotrópico negativo de agonistas muscarínicos en la aurícula aislada de rata. Basados en estos antecedentes, postulamos que la exposición de los RM2 a los Ac anti-RM2 podría promover una inhibición de la señalización estimulada por agonista a través de este receptor. Utilizando procedimientos luminométricos basados en la “transferencia de energía bioluminiscente en resonancia” (BRET) y la activación de acuorina en sistemas de expresión heteróloga (células HEK 293T), demostramos que la fracción IgG sérica de pacientes chagásicos con disautonomía (IgG ChD) modula positivamente la interacción RM2/RM2 e inhibe tanto la señalización acoplada a proteína Gi como el reclutamiento de arrestina-2 (Arr-2) al RM2, cuando ambos procesos son estimulados por agonista. Estos efectos no pudieron ser mimetizados ni por la fracción IgG de individuos controles seronegativos para Ac anti-RM2, ni por el fragmento monovalente Fab de la fracción IgG ChD, sugiriendo que los Ac anti-RM2 bivalentes promueven un cambio conformacional en la molécula del RM2 a través de crosslinking de receptores, afectando de esta manera la activación del receptor por el agonista. Dado que IgG ChD no logró promover ni el reclutamiento de Arr-2 al RM2 ni la internalización de este receptor en células HEK 293T, es improbable que los efectos inhibitorios de los Ac anti-RM2 sobre la señalización mediada por RM2 se deban a una regulación homóloga del receptor a corto plazo. Alternativamente, postulamos que estos Ac ejercen un efecto alostérico negativo sobre el RM2 a través de la interacción con el sitio alostérico común, en el II-LEC. En base a estos resultados proponemos que los efectos inhibitorios de los Ac anti-RM2 sobre la señalización estimulada por acetilcolina, a través de la activación de RM2 cardíacos, podrían contribuir a la inhibición de la función vagal en pacientes chagásicos crónicos. Previous studies have demonstrated a strong association between the presence of circulating IgG autoantibodies against M2 muscarinic acetylcholine receptors (M2R) and evidence for cardiovascular dysautonomia, as well as a significant positive correlation between serum levels of anti-M2R antibodies (Ab) and the degree of vagal inhibition, in chronic Chagas disease patients. Upon binding to the second extracellular loop (II-ECL) of the M2R, these Ab activate their target receptor and thereby stimulate Gi protein-coupled signaling pathways. Besides, anti-M2R Ab can attenuate the negative inotropic effect of muscarinic agonists on rat isolated atria. Based on this background, we proposed that the exposure of M2R to anti-M2R Ab could promote inhibition of agonist-induced M2R-mediated signaling. Using luminometric procedures based on “bioluminescence resonance energy transfer” (BRET) and aequorin activation in heterologous expression systems (HEK 293T cells), we demonstrated that the serum IgG fraction from Chagas disease patients with dysautonomia (ChD IgG) positively modulates M2 receptor/receptor interaction and inhibits both agonist-induced Gi protein-coupled signaling and arrestin-2 recruitment to the M2R. These effects could not be mimicked by the IgG fraction of control individuals, who are seronegative for anti-M2R Ab, or by the monovalent Fab fraction derived from ChD IgG, suggesting that bivalent anti-M2R Ab promote a conformational change in the receptor molecule through receptor crosslinking, thereby impairing agonist-induced receptor activation. Because ChD IgG failed to promote both Arr-2 recruitment to its target receptor and M2R internalization in HEK 293T cells, it is unlikely that the inhibitory effects of anti-M2R Ab on M2R-mediated signalling are due to short-term homologous receptor regulation. Alternatively, we propose that these Ab exert a negative allosteric effect on M2R through interaction with the common allosteric site at the receptor’s II-ECL. Based on these results, we propose that the inhibitory effects of anti-M2R Ab on acetylcholine-stimulated signalling through cardiac M2R activation could contribute to the inhibition of vagal function in chronic Chagas disease patients. Fil: Beltrame, Sabrina Paola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2018 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6516_Beltrame

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