Estudio de la interacción fago-bacteria en Lactobacillus casei

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Los bacteriófagos que infectan bacterias ácido lácticas (BAL) son el principal problema de fallas en la fermentación generando grandes pérdidas económicas. Lactobacillus casei resulta de especial interés porque además de contribuir con las propiedades organolépticas del producto final, muchas cepas...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Dieterle, María Eugenia
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2017
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6271_Dieterle
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Por un lado, la caracterización a nivel genómico y proteómico de los fagos Lactobacillus casei J-1 y PL-1 con particular énfasis en el aparato de reconocimiento del receptor o placa base a nivel estructural y funcional. Por otro, la presencia de profagos presentes en L. casei BL23 con el objetivo de evaluar el riesgo en la generación de fagos con capacidad infectiva en la industria láctea. Las placas base ubicadas en la punta de la cola son grandes complejos multiproteicos conformados por un ensambaje de seis proteínas distales de la cola (Dit), tres proteínas de la cola asociadas a lisinas (Tal) y un número variable de proteínas de unión al receptor (RBPs) que reconocen estructuras presentes en las envolturas bacterianas. Sin embargo, la secuenciación de los fagos J-1 y PL-1 ha mostrado que carecen de las canónicas RBPs. En su lugar, hemos demostrado que la Dit, hasta ahora sólo descripta como estructural, cumple un rol en el reconocimiento del receptor siendo la ramnosa al menos uno de los azúcares reconocidos por estos fagos. En la secuencia de Dit de J-1 y PL-1 existen dos inserciones ausentes en las “clásicas” Dits. La primera inserción presenta homología a módulos de unión a carbohidratos (CBMs, en este caso CBM1) mientras que para la segunda no se encontró similitud. La resolución de la estructura por rayos X de este dominio reveló un plegado similar a CBMs y se lo denominó CBM2. Con el objetivo de descifrar la función de estos módulos, se realizaron ensayos de unión a las bacterias y de inhibición de la adsorción que demostraron que el CBM2, pero no el CBM1, era el responsable del reconocimiento. Ensayos con el polisacárido de pared (CWPS) rico en ramnosa purificado de L. casei BL23 inhibieron la unión del CBM2 a las bacterias. La reconstrucción por microscopía electrónica de la placa base de los viriones enteros muestra que el CBM2 se encuentra en la periferia del complejo, óptimo para reconocer al CWPS. Análisis de secuencia revela que estas Dit evolucionadas están conservadas en fagos que infectan BAL. En resumen, estos resultados identifican a las Dit evolucionadas como los antireceptores en los fagos J-1 y PL-1. A su vez, generando nanoanticuerpos que reconocen al complejo Dit y la región N-terminal de Tal se mostró que uno de ellos bloquea la infección. Por otro lado, Tal tiene la capacidad de hidrolizar el peptidoglicano bacteriano que permitiría la inyección del ADN. Los fagos pueden encontrarse no solo en los sustratos usados como materia prima sino también como profagos en las propias cepas iniciadoras. La inducción de profagos y generación de virus con potencial de infectar otras cepas es un riesgo en la industria láctea. Hemos identificado 3 profagos completos (PLE1, PLE2, PLE3) en el genoma de L. casei BL23. Usando PCR cuantitativa, mostramos que 2 de ellos se inducen aunque con distintas cinéticas (PLE2 y PLE3). Según datos de secuenciación, microscopía electrónica y espectrometría de masa, al menos uno forma un virión potencialmente infectivo. Análisis estructural de las placas base de los profagos muestra nuevamente la presencia de CBMs en las proteínas Dit. Estos resultados resaltan la relevancia de los CBMs en las Dits evolucionadas en los primeros pasos de la infección y sugieren que deberían considerarse como dispositivos bona-fide de adhesión y no solo como proteínas meramente con función estructural como habían sido descriptas hasta hoy. El estudio del complejo multi-proteico involucrado en el reconocimiento al huésped y conservado en fagos que infectan cepas de BAL junto con el estudio de la inducción de profagos aporta datos de relevancia que podrían utilizarse para desarrollar estrategias anti-fágicas en la industria láctea. Bacteriophages infecting Lactic Acid Bacteria (LAB) are the main cause of fermentation failures leading to economic losses. Lactobacillus casei is particularly of interest because besides its contribution with the organoleptic properties, several strains have purported probiotic properties and are part of commercial formulations. The use of these strains is the result of years of research that validated the claimed benefits in food products. Noteworthy, phage attack on these specifically chosen strains is particularly deleterious, as they cannot be replaced easily. On this thesis, we studied two fundamental aspects of phage-bacteria interaction in Lactobacillus casei. On one hand, we characterized Lactobacillus casei phage J-1 and PL-1 at a genomic and proteomic level, particularly we focused on the structure and functionality of the recognition receptor machinery or baseplate. On the other hand, we identified and study prophages in L. casei BL23 to evaluate the risk of infective phage formation in dairy industry. Baseplates are large complexes located at the tip of the tail, the core of which assembles six Distal tail (Dit) proteins , three Tail associated lysin (Tal) proteins and a variable number of Recognition Binding Proteins (RBPs) that recognize receptors of the cell envelope. While most phages possess a dedicated RBP, phage J-1 and PL-1 genome seemed to lack one. We have shown that Dit plays a role in host recognition and that its sequence comprises two inserted modules compared to “classical” Dits. The first insertion was found to be similar to carbohydrate-binding modules (CBMs, here CBM1), whereas the second insertion was undocumented. To decipher the role of these modules, we determined the structure of the second insertion, named CBM2, and found it similar to several CBMs. We found that expressed CBM2, but not CBM1, could bind to L. casei cells and neutralize phage attachment to the bacterial cell wall. Isolated and purified rhamnose-rich cell wall polysacharide (CWPS) of L. casei BL23 prevents CBM2 attachment to the host. Electron microscopy reconstruction of the J-1 virion baseplate revealed that CBM2 is projected at the periphery of Dit to optimally bind the CWPS receptor. Taken together, these results identify J-1 and PL-1 evolved Dit as the phage antireceptor. Moreover, nanobodies raised against J-1 Dit and the N-terminal of Tal complex block infection. Additionally, Tal hydrolyzes the bacteria peptidoglycan to allow phage DNA injection. Bacteriophages can be found on the substrates used for fermentation but they are also found as prophages in the bacterial strains used as starters. Prophage induction and generation of new phages is a risk for dairy industry. We identified three complete prophages (PLE1, PLE2, and PLE3) in the genome of L. casei BL23. Using quantitative realtime PCR, we showed that PLE2 and PLE3 can be induced but with different kinetics. Sequencing, electron microscopy and mass spectrometry analysis showed that at least one of them forms a potential infective virion. A structural analysis of the baseplate proteins of these prophages provides more evidence that CBMs may replace RBPs present in other well-studied LAB phages. These results highlight CBM relevance in evolved Dits at the first steps of infection. Dits should be considered as bona-fide potential adhesion devices and not only as passive hubs. The detailed study of the proteins involved in host recognition and conserved in LAB phages in combination with prophage induction in the prototype L. casei BL23 strain will facilitate the design of new strategies for avoiding phage propagation in dairy industry. Fil: Dieterle, María Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2017 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6271_Dieterle

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