Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing

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La mayoría de los genes eucariotas por la ARN polimerasa II dan lugar a ARNmensajeros “inmaduros” o precursores (pre-ARNm) que contienen exones e intrones. Elsplicing es el proceso mediante el cual los intrones son escindidos de sus exonesflanqueantes y los exones son posteriormente religados para d...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Pozzi, María Berta
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2017
Materias:
SPLICEOSOMA
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
SUMO
SRSF1
PRP3
SPLICEOSOME
POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6164_Pozzi
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Cada snRNP está formado por un ARN pequeño nuclear (snRNA), un set común de proteínas Sm o LSm y un número variable de proteínas específicasde cada partícula. El spliceosoma no existe formado como tal en el núcleo celular sino que seensambla de novo a partir de sus componentes, de manera precisa y ordenada, sobre cadaregión del pre-ARNm que debe ser escindida reconociendo secuencias específicas quedeterminan los sitios de splicing. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron queel factor de splicing SRSF1 es también un regulador de la vía de SUMOilación, ejerciendo unaactividad de tipo E3 ligasa. Estos resultados nos condujeron a explorar una posible conexiónentre las maquinarias de SUMO y splicing, hipotetizando que la conjugación a SUMO podríamodular la dinámica del proceso de splicing al afectar las interacciones entre proteínas yentre éstas y el ARN. En este trabajo, hemos hallado que el agregado de la proteasa de SUMO SENP1 disminuye laeficiencia de splicing in vitro. Por otra parte, el análisis por espectrometría de masa deproteínas inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-SUMO a partir de complejosspliceosomales purificados a distintos tiempos de la reacción de splicing nos permitióidentificar diversas proteínas componentes del spliceosoma como sustratos de SUMOilación. Enfocándonos en una de ellas, la proteína componente del di-snRNP U4/U6 Prp3,detectamos su SUMOilación en células en cultivo y, mediante mutagénesis dirigida, hallamosque las lisinas 289 y 559 son sitios de conjugación de SUMO dentro de esta proteína. Observamos que la doble mutante Prp3 K289/559R, deficiente en SUMOilación, nointeracciona con los snRNAs U2 y U5 ni con las proteínas spliceosomales SF3a1 (componentedel snRNP U2) y Snu 114 (componente del U5 snRNP) a diferencia de la versión salvaje de Prp3, pero sí interacciona con proteínas y snRNAs componentes del di-snRNP. Estosresultados sugieren que el ensamblado de esta partícula (U4/U6) es independientemente dela conjugación de SUMO a Prp3 pero que sin embargo, esta modificación post-traduccionales necesaria para la interacción de Prp3 con las partículas snRNPs de las que ella no formaparte (U2, U5). Además, la versión mutante de Prp3 no logra rescatar los niveles deeficiencia de splicing de pre-ARN mensajeros cuando es sobre-expresada en células encultivo, en comparación a la versión salvaje (wild type), en un contexto de silenciamiento dela proteína endógena. Experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina sugieren queesto responde a un menor reclutamiento de la versión mutante a regiones intrónicas en el ADN, comparada con la versión salvaje, durante el splicing co-transcripcional. Estos hallazgosproponen que la conjugación de SUMO juega un papel importante en el proceso de splicingy sugieren que la SUMOilación de Prp3 participa en la formación o reclutamiento del trisnRNPdurante el ensamblado del spliceosoma. Most eukaryotic genes transcribed by RNA polymerase II give rise to immature messenger RNA or precursor mRNAs (pre-mRNAs) containing exons and introns. The splicing process isresponsible for removing introns and joining exons generating mature mRNAs. This processis carried out by the spliceosome, a multi-mega-dalton ribonucleoprotein complexcomprised by five particles termed “snRNPs” (U1, U2, U4, U5 and U6) and associated factors. Each snRNP is formed by a small nuclear RNA (snRNA), a common set of Sm or LSm proteinsand a variable number of particle-specific proteins. The spliceosome does not exist as such inthe cell nucleus but assembles de novo from its components, in a precise step-wise manner,on every region in the pre-mRNA that has to be removed by the recognition of splicing sites. Previous work from our laboratory demonstrated that the splicing factor SRSF1 is also aregulator of the SUMOylation pathway, displaying an E3 ligase-like activity. These results ledus to explore a possible conexion between the SUMO and splicing machineries,hipothesizing that SUMO conjugation might modulate the dynamics of the splicing processby affecting the interactions between proteins and between these and the RNA. In this work, we have found that addition of the SUMO protease SENP1 diminishes in vitrosplicing efficiency. On the other hand, mass spectrometry analysis of anti-SUMOimmunoprecipated proteins from purified spliceosomal complexes at different steps of thesplicing reaction allowed us to identify many spliceosomal proteins as SUMO substrates. Focusing on one of them, the protein component of the di-snRNP U4/U6 Prp3, we detectedits SUMOylation in cultured cells and, by site directed mutagenesis , found that lysines 289and 559 are SUMO conjugation sites within this protein. We further demonstrated that a Prp3 sumoylation-deficient mutant while still capable of interacting with U4/U6 snRNPcomponents is unable to co-precipitate U2 and U5 snRNA and the spliceosomal proteins U2- SF3a120 and U5-Snu114, unlike the wild type version of this protein. These results suggestthat U4/U6 snRNP assembly is independent of Prp3 SUMOylation. However, this PTM isnecessary for Prp3 interaction with those snRNPs to which it does not belong. Upondepletion of endogenous Prp3, this mutant fails to rescue the splicing efficiency of variouspre-mRNAs when transfected into cultured cells. Prp3 SUMOylation deficient mutant alsoshows a diminished recruitment to active spliceosomes, compared to the wild type protein,assessed by chromatin immunoprecipitaction analysis. These findings indicate that SUMOconjugation plays a role during the splicing process and suggest the involvement of Prp3 SUMOylation in U4/U6.U5 tri-snRNP formation and/ or recruitment. Key words: SPLICEOSOME – POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS – SUMO Fil: Pozzi, María Berta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2017-03-07 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6164_Pozzi

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