Mecanotransducción celular. Correlación entre las propiedades mecánicas y la organización-dinámica de proteínas de adhesión focal en células vivas

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Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señalesexternas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia,cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivelcelular, las respuestas biológicas a fuerzas externas s...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Bianchi, Micaela
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2016
Materias:
MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA
ESPECTROSCOPIA DE FUERZA
MECANOTRANSDUCCION
CELULAS VIVAS
MICROSCOPIA DE FUERZAS DE TRACCION
ATOMIC FORCE MICROSCOPY
FORCE SPECTROSCOPY
MECHANOTRANSDUCTION
LIVING CELLS
TRACTION FORCE MICROSCOPY
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5945_Bianchi
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señalesexternas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia,cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivelcelular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos deestructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y unionesadherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínasdispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a travésde receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitiosde adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadradosque a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que ademásfuncionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransduccióncelular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poderintegrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámicaintracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadasen/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintascondiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de lasproteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivasrequiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada ladinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con unaresolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventostransientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en estetrabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacialy temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, enuna primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía defuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente laimagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades deelasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Seutilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal decubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades desustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también comola línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario deratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK,vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma,empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar laexpresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y,mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética yorganización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusiónde los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante laespectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron loscoeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de lacorrelación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas deadhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínasadhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde laadhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego delfotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesionesfocales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, seempleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneocon el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivode tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que enlas adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayorreclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminuciónsignificativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza detracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista laorganización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidadnecesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustratoelástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopíade fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteínazixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vezque se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP.
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A nivelcelular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos deestructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y unionesadherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínasdispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a travésde receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitiosde adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadradosque a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que ademásfuncionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransduccióncelular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poderintegrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámicaintracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadasen/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintascondiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de lasproteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivasrequiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada ladinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con unaresolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventostransientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en estetrabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacialy temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, enuna primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía defuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente laimagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades deelasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Seutilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal decubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades desustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también comola línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario deratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK,vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma,empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar laexpresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y,mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética yorganización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusiónde los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante laespectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron loscoeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de lacorrelación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas deadhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínasadhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde laadhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego delfotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesionesfocales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, seempleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneocon el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivode tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que enlas adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayorreclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminuciónsignificativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza detracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista laorganización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidadnecesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustratoelástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopíade fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteínazixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vezque se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP. Cells can detect, generate and respond to a wide range of external, chemical andphysical signals, integrate and analyze this information and, consequently, change theirmorphology, dynamics, behavior and, eventually, their fate. At the cellular level,biological responses to external forces are originated from two types of specializedstructures: focal adhesions (cell-extracellular matrix) and adherens junctions (cell-cell). Focal adhesions are protein complexes arranged in multi-molecular assemblies thatbind extracellular matrix, through integral membrane receptors, to cytoskeletalcomponents. These adhesion sites are flat, elongated and few square microns whichare often located in the periphery of the cells, and also function as signaling organellesin the cellular mechanotransduction process. One of the challenges presented to studythe system is to be able to integrate and combine different techniques that allow us toanalyze the intracellular dynamics, biomechanics of the cell/substrate, detection of theforces generated in/by the cell, and observing the global response of the cell indifferent conditions. Thus, the study of the structure, mechanics and dynamics of focaladhesion proteins in response to a mechanical stimulus in living cells requires tovisualize and characterize in an integrated way the dynamics of events located in thecell. These methods must have a high spatial and temporal resolution, so as to detecttransients and highly localized events. In this context, they have been implemented inthis thesis, different microscopies and spectroscopies with high spatial and temporalresolution, combined with the techniques of molecular and cell biology. In order to characterize the mechanical properties of substrates and cells, in a firststep, an advanced mode operation was implemented in atomic force microscopy (AFM), called PF- QNM (Peak Force Quantitative nanomechanical Property Mapping). This mode allows simultaneously obtaining the topography, together with quantitativemaps of the properties such as elasticity, adhesion, hardness, energy dissipation andsurface deformation. Various systems were used with different mechanical propertiesso as to cover the wide range from GPa to kPa, and study the properties of substrates (glass, silicone membranes and polyacrylamide gels), as well as the cell line used inthe Thesis. At focal adhesion level, the strategy was to transfect mouse mammary epithelial cells (HC11), with adhesion proteins (eg zixina, FAK, vinculin, paxillin) fused to visiblefluorescent proteins. Thus, using fluorescence microscopy and spectroscopy, it ispossible to visualize the expression of proteins, register their location and evolutionover time and through different analysis, extract quantitative information about thedynamics, kinetics and organization of focal adhesion complexes. The analysis of thedynamics and distribution of focal adhesion complexes and their interactions wereperformed by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The effective diffusioncoefficients of the proteins mentioned were characterized. The analysis of the crosscorrelationof fluorescence fluctuations of pairs of focal adhesion proteins (FCCS)allowed to demonstrate the interaction between various adhesive proteins in focaladhesion. The dissociation kinetics of proteins from the focal adhesion was evaluatedby fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) under different conditions. To study the changes generated in the organization and dynamics of focal adhesions inliving cells, in response to a global external mechanical stimulus, an equibiaxial tractiondevice adapted to be used simultaneously with the FV1000 confocal microscope wasused. Mechanical tension applied by the pulling device is able to induce changes in thearea of living cells as well as in focal adhesions. In response to mechanical stretchincreased, the recruitment and translocation of the protein zyixin accompanied by asignificant decrease in the dissociation constant was observed. To correlate the mechanical properties of the substrate and the traction forcegenerated by the cell at a focal adhesions level, without losing sight of the organizationand dynamics of proteins in focal adhesion, traction force microscopy was implemented (TFM). This technique has the sensitivity necessary to measure the traction forcegenerated by the cell on an elastic and transparent substrate, which can be combinedwith other fluorescence microscopy techniques such as FRAP or FCS. Analysis of TFMdata for zyxin yielded deformation and traction forces maps, while the dissociationkinetics was evaluated by FRAP. Fil: Bianchi, Micaela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2016-03 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5945_Bianchi

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