Glicómica de parásito : estudio de la vía biosintética de esfingolípidos en Trypanosoma cruzi y Plasmodium falciparum

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Este trabajo presenta un estudio de la vía biosintética de esfingolípidos en dos protozoarios hemoparásitos: Trypanosoma cruzi (formas epimastigote) y Plasmodium falciparum (estadíos intraeritrocíticos) utilizando espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. En una primera etapa se realizó la purificación d...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Piñero, Tamara Alejandra
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2015
Materias:
EM MALDI-TOF
T. CRUZI
P. FALCIPARUM
ESFINGOLIPIDOS
TOMAXIFENO
MALDI-TOF M.S.
FALCIPARUM
SPHINGOLIPIDS
TAMOXIFEN
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5853_Pinero
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Este trabajo presenta un estudio de la vía biosintética de esfingolípidos en dos protozoarios hemoparásitos: Trypanosoma cruzi (formas epimastigote) y Plasmodium falciparum (estadíos intraeritrocíticos) utilizando espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. En una primera etapa se realizó la purificación de la glucosilceramida sintasa, enzima responsable de la transferencia de glucosa desde UDP-glucosa a ceramida, a partir de formas epimastigote de T. cruzi utilizando diferentes pasos cromatográficos. Se demostró que la proteína purificada presentó actividad enzimática específica. A partir de ella fue posible obtener un suero policlonal en ratones con el cual se inmunoprecipitó la enzima activa. Por otra parte, se acopló el anticuerpo a Sepharosa de forma de realizar la inmunopurificación de la enzima en forma más eficiente. Este mismo anticuerpo fue utilizado para la detección de la GCS en otros parásitos. Dado que esta enzima no presenta una secuencia conservada en diferentes sistemas, se realizó un análisis proteómico con la enzima purificada y los resultados fueron comparados en bancos de datos. En una segunda etapa, teniendo en cuenta resultados previos del laboratorio que indicaban que el Tamoxifeno (TAM) inhibe el desarrollo de epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi, se estudió el efecto del TAM sobre el metabolismo de los esfingolípidos no solo en T. cruzi, sino también en P. falciparum y L. amazonensis. Para ello se realizaron incorporaciones metabólicas de ceramidas fluorescentes en cultivos en presencia y ausencia de TAM y se analizaron los esfingolípidos obtenidos por ccd, hplc y espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. En la tercera etapa, haciendo uso de la ingeniería metabólica se desarrolló una nueva metodología para la determinación de glicolípidos. Se realizó la incorporación de N-AzGlcNH2 en los estadíos intraeritrocíticos de P. falciparum. Luego de la extracción de los glicolípidos la utilización de las reacciones denominadas ¨Click¨ permitió la unión de un grupo fluorescente que sería utilizado para la detección durante el fraccionamiento así como para el análisis por espectrometría de masa utilizando el grupo fluorescente como fotosensibilizador, disminuyendo el tiempo de análisis e incrementando la sensibilidad con una mínima preparación de la muestra. Este nuevo método resulta de utilidad para cuantificar cambios dinámicos en el patrón de glicosilación y realizar la determinación estructural directa en diferentes sistemas.
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Se demostró que la proteína purificada presentó actividad enzimática específica. A partir de ella fue posible obtener un suero policlonal en ratones con el cual se inmunoprecipitó la enzima activa. Por otra parte, se acopló el anticuerpo a Sepharosa de forma de realizar la inmunopurificación de la enzima en forma más eficiente. Este mismo anticuerpo fue utilizado para la detección de la GCS en otros parásitos. Dado que esta enzima no presenta una secuencia conservada en diferentes sistemas, se realizó un análisis proteómico con la enzima purificada y los resultados fueron comparados en bancos de datos. En una segunda etapa, teniendo en cuenta resultados previos del laboratorio que indicaban que el Tamoxifeno (TAM) inhibe el desarrollo de epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi, se estudió el efecto del TAM sobre el metabolismo de los esfingolípidos no solo en T. cruzi, sino también en P. falciparum y L. amazonensis. Para ello se realizaron incorporaciones metabólicas de ceramidas fluorescentes en cultivos en presencia y ausencia de TAM y se analizaron los esfingolípidos obtenidos por ccd, hplc y espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. En la tercera etapa, haciendo uso de la ingeniería metabólica se desarrolló una nueva metodología para la determinación de glicolípidos. Se realizó la incorporación de N-AzGlcNH2 en los estadíos intraeritrocíticos de P. falciparum. Luego de la extracción de los glicolípidos la utilización de las reacciones denominadas ¨Click¨ permitió la unión de un grupo fluorescente que sería utilizado para la detección durante el fraccionamiento así como para el análisis por espectrometría de masa utilizando el grupo fluorescente como fotosensibilizador, disminuyendo el tiempo de análisis e incrementando la sensibilidad con una mínima preparación de la muestra. Este nuevo método resulta de utilidad para cuantificar cambios dinámicos en el patrón de glicosilación y realizar la determinación estructural directa en diferentes sistemas. In this work, we present a study of the biosynthetic route of sphingolipids in two hemoparasitic protozoa: Trypanosoma cruzi (epimastigote forms) and Plasmodium falciparum (intraerythrocytic stages), using UV-MALDI-TOF mass spectrometry. Firstly, the purification from epimastigote forms of T. cruzi of the glucosylceramide synthase (GCS), enzyme responsible of transferring glucose from UDP-glucose to ceramide, by different chromatographic steps was performed. The purified protein resulted active and with this protein fraction, a mice polyclonal antibody was obtained. This antibody was able to immunoprecipitate the active enzyme. Furthermore, the antibody was coupled to Sepharose in order to perform the immunopurification of the enzyme more efficiently. The same antibody was used to detect GCS in other parasites. As this enzyme does not present a conserved sequence through different systems, a proteomic approach was performed and the results were compared with data banks. In a second step, taking into account previous results obtained in our lab indicating that Tamoxifen (TAM) inhibits T. cruzi growth the effect of TAM on the sphingolipid metabolism was studied. This study was extended to P. falciparum and L. amazonensis. For this purpose, fluorescent ceramides were metabolically incorporated in cultures containing or not TAM. The labelled sphingolipids were extracted and were analysed by TLC, HPLC and UV-MALDI-TOF mass spectrometry. In the third step, using the metabolic engineering technique, a new method for glycolipid analysis was developed. We performed the metabolic incorporation of N-AzGlcNH2 in the intraerythrocytic stages of P. falciparum. After extraction, the use of ¨click chemistry¨ allowed to link a fluorescent reporter group that resulted useful for the glycolipid detection during fractionation and also for the mass spectrometry analysis as photosensitizer, diminishing the analysis time while increasing sensitivity with a minimum sample preparation. This new methodology is useful to quantify dynamic changes of the glycolipid pattern as well as to perform direct structural determination in different systems. Fil: Piñero, Tamara Alejandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2015 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/restrictedAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5853_Pinero

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