Caracterización bioquímica y funcional de las dos UDP-Glc : glicoproteína glucosiltransferasas codificadas en el genoma de C. elegans

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La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es el sensor de la conformación de las glicoproteínas en el “Control de Calidad de Plegamiento de Glicoproteínas” ya que sólo presenta actividad sobre glicoproteínas que no se encuentran en su conformación nativa. Las glicoproteínas que presentan o...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Buzzi, Lucila Inés
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2013
Materias:
GLUCOSILTRANSFERASA
RETICULO ENDOPLASMICO
N-GLICOSILACION
PLEGAMIENTO DE GLICOPROTEINAS
UGGT
CONTROL DE CALIDAD
CAENORHABDITIS ELEGANS
DESARROLLO
GLUCOSYLTRANSFERASE
ENDOPLASMIC RETICULUM
N-GLYCOSYLATION
GLYCOPROTEIN FOLDING
QUALITY CONTROL
DEVELOPMENT
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5401_Buzzi
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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QUALITY CONTROL
CAENORHABDITIS ELEGANS
DEVELOPMENT
description La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es el sensor de la conformación de las glicoproteínas en el “Control de Calidad de Plegamiento de Glicoproteínas” ya que sólo presenta actividad sobre glicoproteínas que no se encuentran en su conformación nativa. Las glicoproteínas que presentan oligosacáridos monoglucosilados interaccionan con lectinas-chaperonas presentes en el Retículo endoplásmico (RE) como Calnexina y Calreticulina lo cual previene que los intermediarios de plegamiento inmaduros continúen su camino hacia el Aparato de Golgi. En C. elegans existen dos genes, uggt-1 y uggt-2, homólogos a los que codifican para las UGGT en diferentes organismos. La expresión de las proteínas UGGT-1 y UGGT-2 en S. pombe alg6 gpt1-, que carece de actividad de UGGT, permitió demostrar que uggt-1 codifica para una UGGT activa (CeUGGT-1), mientras que la proteína codificada por uggt-2 carece de actividad de UGGT (CeUGGT-2). Mediante la construcción de proteínas quiméricas, se determinó que el dominio C-terminal de CeUGGT-2 es incapaz de transferir glucosa a proteínas mal plegadas. El estudio del gusano mutante de uggt-2 (VC1961) reveló que CeUGGT-2 es esencial para la viablidad del nematodo ya que los gusanos uggt-2 -/- se arrestan en estadíos embrionarios y en L1 mostrando un tamaño menor y posibles defectos en la cutícula. Mediante Real Time PCR observamos que ambos genes se expresan durante todo el ciclo de vida de C. elegans. Mediante la construcción de gusanos transgénicos pudimos detectar expresión de CeUGGT-1 en todas las células y tejidos del nematodo. uggt-1 se induce en condiciones de estrés de RE a través de la vía de señalización de ire-1 en la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), mientras que uggt-2 no lo hace. El silenciamiento de la expresión de la proteína UGGT-1 y UGGT-2 por ensayos de RNAi produjeron un retraso en el desarrollo en gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) y resultaron en una disminución de la sobrevida de gusanos uggt-1(RNAi). CeUGGT-1 y CeUGGT-2 juegan un rol protector ante condiciones de estrés de RE ya que con 10 μg/ml de Tunicamicina (TN) se arrestó el crecimiento de gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) en L2/L3 pero no el de gusanos control. Además ensayos de RNAi a bajas concentraciones de TN en ausencia de ire-1, sugirieron que CeUGGT-2 es importante para aliviar los bajos niveles de estrés de RE en ausencia de esta vía de la UPR. Estos resultados indicarían que ambos homólogos de UGGT de C. elegans poseerían distintas funciones biológicas.
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spelling todo:tesis_n5401_Buzzi2023-10-03T12:56:48Z Caracterización bioquímica y funcional de las dos UDP-Glc : glicoproteína glucosiltransferasas codificadas en el genoma de C. elegans Biochemical and functional characterization of the two UDP-Glc: glycoprotein glucosyltransferase codified in C. elegans genome Buzzi, Lucila Inés GLUCOSILTRANSFERASA RETICULO ENDOPLASMICO N-GLICOSILACION PLEGAMIENTO DE GLICOPROTEINAS UGGT CONTROL DE CALIDAD CAENORHABDITIS ELEGANS DESARROLLO GLUCOSYLTRANSFERASE ENDOPLASMIC RETICULUM N-GLYCOSYLATION GLYCOPROTEIN FOLDING UGGT QUALITY CONTROL CAENORHABDITIS ELEGANS DEVELOPMENT La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es el sensor de la conformación de las glicoproteínas en el “Control de Calidad de Plegamiento de Glicoproteínas” ya que sólo presenta actividad sobre glicoproteínas que no se encuentran en su conformación nativa. Las glicoproteínas que presentan oligosacáridos monoglucosilados interaccionan con lectinas-chaperonas presentes en el Retículo endoplásmico (RE) como Calnexina y Calreticulina lo cual previene que los intermediarios de plegamiento inmaduros continúen su camino hacia el Aparato de Golgi. En C. elegans existen dos genes, uggt-1 y uggt-2, homólogos a los que codifican para las UGGT en diferentes organismos. La expresión de las proteínas UGGT-1 y UGGT-2 en S. pombe alg6 gpt1-, que carece de actividad de UGGT, permitió demostrar que uggt-1 codifica para una UGGT activa (CeUGGT-1), mientras que la proteína codificada por uggt-2 carece de actividad de UGGT (CeUGGT-2). Mediante la construcción de proteínas quiméricas, se determinó que el dominio C-terminal de CeUGGT-2 es incapaz de transferir glucosa a proteínas mal plegadas. El estudio del gusano mutante de uggt-2 (VC1961) reveló que CeUGGT-2 es esencial para la viablidad del nematodo ya que los gusanos uggt-2 -/- se arrestan en estadíos embrionarios y en L1 mostrando un tamaño menor y posibles defectos en la cutícula. Mediante Real Time PCR observamos que ambos genes se expresan durante todo el ciclo de vida de C. elegans. Mediante la construcción de gusanos transgénicos pudimos detectar expresión de CeUGGT-1 en todas las células y tejidos del nematodo. uggt-1 se induce en condiciones de estrés de RE a través de la vía de señalización de ire-1 en la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), mientras que uggt-2 no lo hace. El silenciamiento de la expresión de la proteína UGGT-1 y UGGT-2 por ensayos de RNAi produjeron un retraso en el desarrollo en gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) y resultaron en una disminución de la sobrevida de gusanos uggt-1(RNAi). CeUGGT-1 y CeUGGT-2 juegan un rol protector ante condiciones de estrés de RE ya que con 10 μg/ml de Tunicamicina (TN) se arrestó el crecimiento de gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) en L2/L3 pero no el de gusanos control. Además ensayos de RNAi a bajas concentraciones de TN en ausencia de ire-1, sugirieron que CeUGGT-2 es importante para aliviar los bajos niveles de estrés de RE en ausencia de esta vía de la UPR. Estos resultados indicarían que ambos homólogos de UGGT de C. elegans poseerían distintas funciones biológicas. The UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT) is the sensor of glycoprotein conformations in the glycoprotein folding quality control as it exclusively glucosylates glycoproteins not displaying their native conformations. Monoglucosylated glycoproteins thus formed may interact with the lectin-chaperones calnexin and calreticulin. This interaction prevents premature exit of folding intermediates to the Golgi. Bioinformatic analysis showed that in C. elegans there are two genes, uggt-1 and uggt-2, coding for UGGT homologues. Expression of both genes in S. pombe mutants devoid of UGGT activity showed that uggt-1 codes for an active UGGT protein (CeUGGT-1). On the other hand, uggt-2 coded for a protein (CeUGGT-2) apparently not displaying a canonical UGGT activity and conversely to what happens in humans, the C-terminal domain of CeUGGT-2 is inactive. However, uggt-2 is not a pseudogene as we can detect its expression along the entire development. The study of the mutant worm VC1961 revealed that CeUGGT-2 is essential for viability. Worms uggt-2 -/- were arrested in embryonic and L1 stages and they showed smaller size and possible defects in the cuticle. Furthermore, Real-time PCR analysis showed that both uggt-1 and uggt-2 genes are expressed during the entire C. elegans life cycle. Moreover, transgenic worms constructed by fosmid recombineering technique carrying the gfp under the control of uggt-1 promoter indicated that that CeUGGT-1 is expressed in all cells and tissues of the nematode. uggt-1, but not uggt-2, is upregulated under ER stress through the ire-1 arm of the unfolded protein response (UPR). RNAi-mediated depletion of CeUGGT-1 but not of CeUGGT-2 resulted in a reduced lifespan and that of CeUGGT-1 and CeUGGT-2 in a developmental delay. We found that both CeUGGT1 and CeUGGT2 play a protective role under ER stress conditions, since 10 μg/ml tunicamycin (TN) arrested development at the L2/L3 stage of both uggt-1(RNAi) and uggt-2(RNAi) but not of control worms. Furthermore, we found that the role of CeUGGT-2 but not CeUGGT-1 is significant in relieving low ER stress levels simulated with TN in the absence of the ire-1 unfolding protein response signaling pathway. Our results indicate that both C. elegans UGGT homologues may have distinct biological functions. Fil: Buzzi, Lucila Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2013 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5401_Buzzi

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