Caracterización de los complejos SCF y estudio de la función de la proteína F-box Slimb en la ovogénesis de Drosophila melanogaster

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La degradación de proteínas mediada por el sistema ubiquitina/proteasoma es un mecanismo de control de la abundancia de proteínas específicas dentro de la célula. Muchas proteínas son marcadas para su degradación por una familia de E3 ubiquitin-ligasas multiméricas, denominadas complejos SCF. Estos...

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Autor principal: Muzzopappa, Mariana
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2005
Materias:
UBIQUITINA
COMPLEJO SCF
F-BOX
SLIMB
OVOGENESIS
DROSOPHILA
UBIQUITIN
SCF COMPLEX
OOGENESIS
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3893_Muzzopappa
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La degradación de proteínas mediada por el sistema ubiquitina/proteasoma es un mecanismo de control de la abundancia de proteínas específicas dentro de la célula. Muchas proteínas son marcadas para su degradación por una familia de E3 ubiquitin-ligasas multiméricas, denominadas complejos SCF. Estos complejos están compuestos por tres polipéptidos constantes – Skp1, Cdc53/Cul1, Rbx1/Hrt1 – y un cuarto componente variable, la proteína adaptadora con motivo F-box. Utilizando el sistema del doble híbrido de levaduras, como así también ensayos de interacción in vitro, hemos identificado por primera vez a los componentes del núcleo invariante de los complejos SCF en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Mediante experimentos de complementación funcional en S.cerevisiae demostramos que la proteína Rbx1 de Drosophila puede restaurar la viabilidad de mutantes hrt1 de levaduras, indicando que los complejos SCF están funcionalmente conservados en la evolución. Slimb es una proteína de Drosophila con motivo F-box, que cumple distintas funciones en el desarrollo y la fisiología celular. En esta tesis, hemos analizado la función de Slimb durante la ovogénesis de Drosophila. Demostramos que la pérdida de función de Slimb en la línea germinal provoca una reducción en los niveles de dE2F2 y Dp, lo cual se correlaciona con alteraciones en la regulación de los ciclos mitóticos durante la formación del cisto, con anomalías en la endorreplicación del genoma de las células nodrizas y con defectos en el vertido del contenido del citoplasma de las células nodrizas dentro del ovocito. Nuestros resultados sugieren que Slimb regula indirectamente los niveles de E2F2 y Dp, controlando de esta manera el desarrollo del cisto. Por otro lado, la generación de clones mutantes slimb en la línea somática del ovario dio lugar a la aparición de alteraciones en la morfología del germario y a defectos en la encapsulación del cisto por parte del epitelio folicular. Asimismo, ovarios con clones somáticos slimb exhibieron retrasos en la diferenciación del epitelio folicular, lo cual se correlacionó con la aparición de células polares ectópicas, falta de tallos interfoliculares y deslocalización del ovocito dentro del folículo. Encontramos también que en la ovogénesis media, Slimb se necesita en el epitelio folicular para especificar a las células foliculares que darán origen a los apéndices dorsales. La hiperactivación débil de la vía de Dpp dio lugar a la aparición de fenotipos semejantes a los de pérdida de función de slimb, los cuales fueron totalmente suprimidos cuando se sobre-expresó la proteína Slimb simultáneamente con Dpp. Significativamente, en ovarios con clones slimb se observó la expresión ectópica del gen Broad-Complex y del reportero transcripcional dad-LacZ, como así también una acumulación anormal de la proteína co-Smad, Medea. Proponemos que Slimb normalmente regula negativamente a la vía de Dpp, destinando a degradación a la proteína Medea. Finalmente, proporcionamos evidencias de que Slimb interacciona genéticamente con componentes y con reguladores de los complejos SCF, sugiriendo que Slimb funciona como subunidad adaptadora de este complejo en el ovario de Drosophila.
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Utilizando el sistema del doble híbrido de levaduras, como así también ensayos de interacción in vitro, hemos identificado por primera vez a los componentes del núcleo invariante de los complejos SCF en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Mediante experimentos de complementación funcional en S.cerevisiae demostramos que la proteína Rbx1 de Drosophila puede restaurar la viabilidad de mutantes hrt1 de levaduras, indicando que los complejos SCF están funcionalmente conservados en la evolución. Slimb es una proteína de Drosophila con motivo F-box, que cumple distintas funciones en el desarrollo y la fisiología celular. En esta tesis, hemos analizado la función de Slimb durante la ovogénesis de Drosophila. Demostramos que la pérdida de función de Slimb en la línea germinal provoca una reducción en los niveles de dE2F2 y Dp, lo cual se correlaciona con alteraciones en la regulación de los ciclos mitóticos durante la formación del cisto, con anomalías en la endorreplicación del genoma de las células nodrizas y con defectos en el vertido del contenido del citoplasma de las células nodrizas dentro del ovocito. Nuestros resultados sugieren que Slimb regula indirectamente los niveles de E2F2 y Dp, controlando de esta manera el desarrollo del cisto. Por otro lado, la generación de clones mutantes slimb en la línea somática del ovario dio lugar a la aparición de alteraciones en la morfología del germario y a defectos en la encapsulación del cisto por parte del epitelio folicular. Asimismo, ovarios con clones somáticos slimb exhibieron retrasos en la diferenciación del epitelio folicular, lo cual se correlacionó con la aparición de células polares ectópicas, falta de tallos interfoliculares y deslocalización del ovocito dentro del folículo. Encontramos también que en la ovogénesis media, Slimb se necesita en el epitelio folicular para especificar a las células foliculares que darán origen a los apéndices dorsales. La hiperactivación débil de la vía de Dpp dio lugar a la aparición de fenotipos semejantes a los de pérdida de función de slimb, los cuales fueron totalmente suprimidos cuando se sobre-expresó la proteína Slimb simultáneamente con Dpp. Significativamente, en ovarios con clones slimb se observó la expresión ectópica del gen Broad-Complex y del reportero transcripcional dad-LacZ, como así también una acumulación anormal de la proteína co-Smad, Medea. Proponemos que Slimb normalmente regula negativamente a la vía de Dpp, destinando a degradación a la proteína Medea. Finalmente, proporcionamos evidencias de que Slimb interacciona genéticamente con componentes y con reguladores de los complejos SCF, sugiriendo que Slimb funciona como subunidad adaptadora de este complejo en el ovario de Drosophila. Ubiquitin/proteasome mediated proteolysis is a commonly employed mechanism for the control of protein abundance in the cell. Many proteins are targeted for degradation by a family of multimeric E3 ubiquitin ligases, termed SCF complexes. These complexes are composed of three constant proteins- Skp1, Cdc53/Cul1, Rbx1/Hrt1- and a variable adaptor subunit, the Fbox protein. By utilizing the yeast two hybrid system and in vitro interactions we have identified for the first time the components and overall structure of the basic SCF complex in Drosophila melanogaster. A functional complementation test performed in a S.cerevisiae showed that Drosophila Rbx1 can restore the viability of yeast hrt1 mutant cells, indicating that the complex is functionally conserved throughout evolution. Slimb (Slmb) is a Drosophila F-Box protein that fulfills several roles in development and cell physiology. We have analyzed here its participation in egg chamber development by generating mutant clones in the ovary. slmb loss of function in the germline provoked a reduction in dE2F2 and dDP levels, which correlated with misregulation of mitotic cycles during cyst formation, abnormal nurse cell endoreplication and impairment of dumping of the nurse cell content into the oocyte. We suggest that Slmb indirectly downregulates E2F2 and Dp levels, thereby controlling mitotic and endocycle replication during cyst development, as well as the processess of nurse cell dumping and apoptosis. slmb mutant clones in the somatic line caused alterations in the morphology of the germarium and defects in encapsulation of the cyst. Furthermore, slmb somatic clones exhibited a delay in follicle cell differentiation, which correlated with the occurrence of ectopic polar cells, lack of interfollicular stalks and mislocalization of the oocyte. We found that, at midoogenesis, Slmb was required in the follicular epithelium to specify the shape and position of two patches of cells that will give rise to dorsal appendages. Mild overactivation of the Dpp pathway provoked similar phenotypes that could be antagonized by simultaneous overexpression of Slmb and interestingly, ectopic expression of the Broad-Complex gene and of a dad-LacZ reporter element, as well as over-accumulation of the co-Smad protein Medea, were recorded in slmb somatic clones. We propose that Slimb normally downregulates the Dpp pathway in follicle cells by targeting Medea for proteasomal degradation. Finally, we provide evidences that Slmb genetically interacts with components and regulators of the SCF complex, suggesting that Slmb functions as a subunit of an SCF complex in the ovary. Fil: Muzzopappa, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2005 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3893_Muzzopappa

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