Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa
Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la informaciónexistente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo selleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la ló...
Guardado en:
| Autor principal: | |
|---|---|
| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2004
|
| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3745_Santos |
| Aporte de: |
| id |
todo:tesis_n3745_Santos |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
Universidad de Buenos Aires |
| institution_str |
I-28 |
| repository_str |
R-134 |
| collection |
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) |
| language |
Español |
| orig_language_str_mv |
Español |
| topic |
PLEGADO PROTEINA FRAGMENTO INFORMACION ESTADOS PARCIALMENTE PLEGADOS SS-LACTAMASA FOLDING PROTEIN TRUNCATED INFORMATION PARTIALLY FOLDED STATE SS-LACTAMASE FRAGMENT |
| spellingShingle |
PLEGADO PROTEINA FRAGMENTO INFORMACION ESTADOS PARCIALMENTE PLEGADOS SS-LACTAMASA FOLDING PROTEIN TRUNCATED INFORMATION PARTIALLY FOLDED STATE SS-LACTAMASE FRAGMENT Santos, Javier Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa |
| topic_facet |
PLEGADO PROTEINA FRAGMENTO INFORMACION ESTADOS PARCIALMENTE PLEGADOS SS-LACTAMASA FOLDING PROTEIN TRUNCATED INFORMATION PARTIALLY FOLDED STATE SS-LACTAMASE FRAGMENT |
| description |
Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la informaciónexistente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo selleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la lógica con que se distribuye lainformación 3D en la secuencia y no existe una opinion unificada sobre el grado deestructura presente en los estados parcialmente plegados ni sobre el papel de estosúltimos en el plegado proteico. Sí existen algunas pruebas de que la información conformacional no estaria distribuidahomogéneamente en la secuencia proteica. En una misma cadena polipeptídica existenfragmentos o bloques que pueden ser eliminados sin producir alteraciones en el plegadofinal, por lo que no formarían parte del conjunto de residuos determinantes de laestructura 3D nativa. Por el contrario, otros fragmentos aparentemente no pueden serremovidos sin abortar el proceso de plegado. En este trabajo de tesis se utilizó a la β-lactamasa de Bacillus Licheniformis. ES-βLcomo modelo experimental para estudiar el proceso de conversión de información 1D → 3D e investigar la existencia de módulos de información para el plegado. Se eligió a ES-βL como modelo principalmente porque a) la existencia de proteínacorrectamente plegada (nativa) es fácilmente detectable por actividad enzimática. aúnen trazas; b) se conoce su estructura cristalográfica con gran resolución; c) no poseepuentes disulfuro que compliquen adicionalmente el plegado; y d) ES-βL no es unmodelo excesivamente reduccionista: posee dos dominios y una topologíamedianamente intrincada. Para caracterizar el modelo experimental se estudiaron aspectos generales de laestructura, el plegado, y estados intermediarios de ES-βL, tanto desde un punto de vistacinético como en el equilibrio. La estructura de formas parcialmente plegadas tambiénse estudió a partir de experimentos de modificación química de cisteínas introducidas atal fin en la cadena polipeptídica como sondas conformacionales. El desplegado de ES-βL inducido por urea presentó más complejidad que el desplegadopor GdmCl. En el primer caso, se detectaron por lo menos cuatro estados parcialmenteplegados. Inesperadamente, el reemplazo de Ser265 → Cys265 tuvo consecuencias importantespara el plegado. El efecto desestabilizador de la mutación sobre los estadosparcialmente plegados indicó que el residuo formaría parte de un módulo estructuradoen dichos estados. La observación de estados parcialmente plegados, curvas de desnaturalización nocoincidentes, transiciones multifásicas, cores resistentes e intermediarios cinéticos escompatible con un mecanismo de ensamblado modular o plegado por partes de laβ-lactamasa. Por otra parte, en este trabajo se manipuló la secuencia de la proteína para estudiar lainterdependencia de los niveles jerárquicos de estructura en el proceso de plegado. Se evaluó el contenido de información para el plegado de ES-βL codificado por lahélice α C-terminal. Para estudiar el papel de esta hélice se prepararon y caracterizarontres variantes de ES-βL acertadas, en nueve, catorce y diecinueve residuos desde el C-terminal. ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 y ES-βLͨΔ19, respectivamente. Los lisados debacterias expresando ES-βLͨΔ19 no presentaron actividad β-lactamasa. Por el contrario,dicha actividad sí fue detectada en lisados conteniendo tanto ES-βLͨΔ9 como ES-βLͨΔ14,demostrando de manera preliminar que una fracción de estas moléculas, puede adquirirestructura nativa. La caracterización rigurosa de ES-βLͨΔ9 permitió demostrar que la secuencia deresiduos eliminada tiene un rol en el mecanismo de plegado pero que su ausencia noimpide la formación de estructura 3D nativa. También se caracterizó en detalle Ip ES-βLͨΔ9, un estado parcialmente plegado, queestá conectado con la forma nativa de ES-βLͨΔ9. Ip ES-βLͨΔ9 sólo posee estructurasecundaria residual, pero es muy compacto. Posee las características de un glóbulofundido y puede esmbilizarse formando un dímero. La eliminación de los residuos 287-295 afecta dramáticamente la velocidad dereplegado de la β-lactamasa: ES-βLͨΔ9 se pliega 10 4 veces más lentamente que ES-βL. A partir del estudio tennodinámico y cinético de ES-βLͨΔ9 se concluyó que los residuoseliminados proveen información para formar estructura secundaria, evitar trampascinéticas y asociación errónea de unidades de plegado, acelerar el pasaje a través delestado de transición y estabilizar al estado nativo. Los resultados obtenidos con la β-lactamasa se compararon con otros datos de literaturareferidos a proteínas que a pesar de carecer de partes de su secuencia alcanzan unplegado nativo. El conjunto de las evidencias experimentales parece sugerir que lacadena polipeptídica tiende a plegarse guiada principalmente por información local enla secuencia. Las interacciones entre residuos alejados secuencialmente jugarían unpapel secundario en el proceso de plegado y aparecerían posteriormente, luego de que lacadena polipeptídica adopte el recorrido espacial apropiado. |
| format |
Tesis Doctoral |
| author |
Santos, Javier |
| author_facet |
Santos, Javier |
| author_sort |
Santos, Javier |
| title |
Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa |
| title_short |
Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa |
| title_full |
Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa |
| title_fullStr |
Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa |
| title_full_unstemmed |
Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa |
| title_sort |
estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa |
| publishDate |
2004 |
| url |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3745_Santos |
| work_keys_str_mv |
AT santosjavier estudiodelplegadoproteicolaßlactamasa AT santosjavier proteinfoldingstudyßlactamase |
| _version_ |
1782025143392927744 |
| spelling |
todo:tesis_n3745_Santos2023-10-03T12:43:18Z Estudio del plegado proteico : la ß-lactamasa Protein folding study : ß-lactamase Santos, Javier PLEGADO PROTEINA FRAGMENTO INFORMACION ESTADOS PARCIALMENTE PLEGADOS SS-LACTAMASA FOLDING PROTEIN TRUNCATED INFORMATION PARTIALLY FOLDED STATE SS-LACTAMASE FRAGMENT Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la informaciónexistente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo selleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la lógica con que se distribuye lainformación 3D en la secuencia y no existe una opinion unificada sobre el grado deestructura presente en los estados parcialmente plegados ni sobre el papel de estosúltimos en el plegado proteico. Sí existen algunas pruebas de que la información conformacional no estaria distribuidahomogéneamente en la secuencia proteica. En una misma cadena polipeptídica existenfragmentos o bloques que pueden ser eliminados sin producir alteraciones en el plegadofinal, por lo que no formarían parte del conjunto de residuos determinantes de laestructura 3D nativa. Por el contrario, otros fragmentos aparentemente no pueden serremovidos sin abortar el proceso de plegado. En este trabajo de tesis se utilizó a la β-lactamasa de Bacillus Licheniformis. ES-βLcomo modelo experimental para estudiar el proceso de conversión de información 1D → 3D e investigar la existencia de módulos de información para el plegado. Se eligió a ES-βL como modelo principalmente porque a) la existencia de proteínacorrectamente plegada (nativa) es fácilmente detectable por actividad enzimática. aúnen trazas; b) se conoce su estructura cristalográfica con gran resolución; c) no poseepuentes disulfuro que compliquen adicionalmente el plegado; y d) ES-βL no es unmodelo excesivamente reduccionista: posee dos dominios y una topologíamedianamente intrincada. Para caracterizar el modelo experimental se estudiaron aspectos generales de laestructura, el plegado, y estados intermediarios de ES-βL, tanto desde un punto de vistacinético como en el equilibrio. La estructura de formas parcialmente plegadas tambiénse estudió a partir de experimentos de modificación química de cisteínas introducidas atal fin en la cadena polipeptídica como sondas conformacionales. El desplegado de ES-βL inducido por urea presentó más complejidad que el desplegadopor GdmCl. En el primer caso, se detectaron por lo menos cuatro estados parcialmenteplegados. Inesperadamente, el reemplazo de Ser265 → Cys265 tuvo consecuencias importantespara el plegado. El efecto desestabilizador de la mutación sobre los estadosparcialmente plegados indicó que el residuo formaría parte de un módulo estructuradoen dichos estados. La observación de estados parcialmente plegados, curvas de desnaturalización nocoincidentes, transiciones multifásicas, cores resistentes e intermediarios cinéticos escompatible con un mecanismo de ensamblado modular o plegado por partes de laβ-lactamasa. Por otra parte, en este trabajo se manipuló la secuencia de la proteína para estudiar lainterdependencia de los niveles jerárquicos de estructura en el proceso de plegado. Se evaluó el contenido de información para el plegado de ES-βL codificado por lahélice α C-terminal. Para estudiar el papel de esta hélice se prepararon y caracterizarontres variantes de ES-βL acertadas, en nueve, catorce y diecinueve residuos desde el C-terminal. ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 y ES-βLͨΔ19, respectivamente. Los lisados debacterias expresando ES-βLͨΔ19 no presentaron actividad β-lactamasa. Por el contrario,dicha actividad sí fue detectada en lisados conteniendo tanto ES-βLͨΔ9 como ES-βLͨΔ14,demostrando de manera preliminar que una fracción de estas moléculas, puede adquirirestructura nativa. La caracterización rigurosa de ES-βLͨΔ9 permitió demostrar que la secuencia deresiduos eliminada tiene un rol en el mecanismo de plegado pero que su ausencia noimpide la formación de estructura 3D nativa. También se caracterizó en detalle Ip ES-βLͨΔ9, un estado parcialmente plegado, queestá conectado con la forma nativa de ES-βLͨΔ9. Ip ES-βLͨΔ9 sólo posee estructurasecundaria residual, pero es muy compacto. Posee las características de un glóbulofundido y puede esmbilizarse formando un dímero. La eliminación de los residuos 287-295 afecta dramáticamente la velocidad dereplegado de la β-lactamasa: ES-βLͨΔ9 se pliega 10 4 veces más lentamente que ES-βL. A partir del estudio tennodinámico y cinético de ES-βLͨΔ9 se concluyó que los residuoseliminados proveen información para formar estructura secundaria, evitar trampascinéticas y asociación errónea de unidades de plegado, acelerar el pasaje a través delestado de transición y estabilizar al estado nativo. Los resultados obtenidos con la β-lactamasa se compararon con otros datos de literaturareferidos a proteínas que a pesar de carecer de partes de su secuencia alcanzan unplegado nativo. El conjunto de las evidencias experimentales parece sugerir que lacadena polipeptídica tiende a plegarse guiada principalmente por información local enla secuencia. Las interacciones entre residuos alejados secuencialmente jugarían unpapel secundario en el proceso de plegado y aparecerían posteriormente, luego de que lacadena polipeptídica adopte el recorrido espacial apropiado. The biological properties of proteins rest upon their specific native three-dimensional structure. andit is known that protein native structure is the result of a folding process by which sequentialinformation is spontaneously converted into three-dimensional information. However, it isunknown how the three-dimensional information is encoded by the sequence. Moreover, althoughthe native, biologically active, conformation can be characterized in atomic detail, a clearunderstanding of the structure of unfolded and partially folded states is also lacking. There are evidences suggesting that the information content is not homogenously distributed in theprotein sequence: there exist particular fragments or blocks of sequence that can be eliminatedwithout producing major alterations in the native structure, whereas other fragments, or even singleresidues, cannot be removed without impeding the folding process. In this work, β-lactamase of Bacillus licheniformis (ES-βL) was used as an experimental model to study the conversion ofsequential information into three-dimensional information, and to investigate the existence ofinformation modules embedded in the polypeptide chain. ES-βL was chosen as a protein folding model because: a) even traces of its native state can bedetected by measuring enzymatic activity; b) its crystal structure is known with high resolution; c) itdoes not have disulfide bridges that would additionally complicate the folding reaction; d) it isrepresentative of medium-size proteins with two domains and a moderately intricate topology. In the first part of the work, to characterize the experimental model, native and intermediary statesof ES-βL, were studied by kinetics, equilibrium unfolding experiments, and chemical modificationof Ser → Cys mutants. At least four partially folded states with different spectroscopic properties orthiol accessibility were detected in ES-βL equilibrium unfolding. Unexpectedly, it was found that a Ser265 → Cys265 replacement destabilized selectively ES-βL partially folded intermediatesindicating Ser265 is establishing fixed interactions in these states. In addition the results showed the presence of partially folded states, no coincident curves whenunfolding was monitored by different probes, multiphase transitions, protease resistant cores, andkinetic intermediaries. All these features suggest a modular assembling mechanism for β-lactamase. In the second part of the work, the sequence of β-lactamase was manipulated to study theinterdependence of the hierarchic levels of structure (modules, independent units, topomer, nativestructure, etc.) in the folding process. Sequential information was eliminated with the expectation ofstopping folding at different levels of structural complexity. In particular, the information contentencoded by the C-terminal helix of ES-βL was evaluated. Three variants shortened by nine,fourteen and nineteen residues from the C-terminal were prepared and characterized (ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 and ES-βLͨΔ19, respectively). For ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14, most of the protein was wasfound forming inclusion bodies (insoluble aggregates) in transformed E. coli cells. Neither lysatesof untransformed E. coli cells nor cells expressing ES-βLͨΔ19 had detectable lactamase activity. Contrastingly, lysates containing ES-βLͨΔ9 or ES-βLͨΔ14 exhibited enxymatic activity, whichdemonstrated that a fraction of these proteins acquired a properly folded structure in vivo. A thorough characterization of ES-βLCͨΔ19(hydrodynamics, spectroscopic and thermodynamicproperties, enzymatic activity and resistance to proteolysis) allowed demonstrating that theeliminated sequence does have a role in the folding mechanism, but its absence does not prevent theacquisition of native structure. Also Ip ES-βLͨΔ9, a partially folded state, was discovered andcharacterized. Ip ES-βLͨΔ9 lacks tertiary structure, but it is compact and possesses residualsecondary structure. These features are typical of molten globules, but this one is unusual because itforms a dímer in a concentration dependent process. ES-βLͨΔ9 folds 10 4 times more slowly than ES-βL. From a thorough thermodynamic and kinetic study of ES-βLͨΔ9, it is concluded that theeliminated residues (287-295) participate in folding at different levels: (a) encoding secondarystructure; (b) encoding tertiary structure indirectly, avoiding kinetic traps and erroneous associationof folding units; (c) participating in the folding transition state; (d) stabilizing the native state. Finally, in this thesis work it is discussed available experimental information on native proteinslacking parts of their sequences, and the relevance of these results to protein folding. Fil: Santos, Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2004 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3745_Santos |