Identificación y caracterización de enzimas involucradas en la regulación de los niveles de AMPc en Trypanosoma cruzi

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En este trabajo se caracterizó la adenilil ciclasa TczAC. Se determinó que el gen que codifica para esta enzima se encuentra altamente conservado con los genes de adenilil ciclasas identificados en otros tripanosomátidos, es parte de una familia multigénica y se expresa en todos los estadios del cic...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: D'Angelo, Maximiliano A.
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2003
Materias:
ADENILIL CICLASA
FOSFODIESTERASA
CALCIO
FLAGELO
TRYPANOSOMA
ADENYLYL CYCLASE
PHOSPHODIESTERASE
CALCIUM
FLAGELLUM
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3565_DAngelo
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description En este trabajo se caracterizó la adenilil ciclasa TczAC. Se determinó que el gen que codifica para esta enzima se encuentra altamente conservado con los genes de adenilil ciclasas identificados en otros tripanosomátidos, es parte de una familia multigénica y se expresa en todos los estadios del ciclo de vida de T. cruzi. Se determinó que el producto de este gen es una enzima funcional capaz de complementar una cepa de levaduras carente de actividad adenilil ciclasa. Esta enzima es específica para AMPc, presenta una mayor actividad en presencia de Mn+2 que de Mg+2 y es inhibida por Zn+2 y el inhibidor del sitio P, 2'-deoxy-3'AMP. Por otro lado, el Ca+2 estimula la actividad de la misma manera independiente de calmodulina. Utilizando la técnica de doble híbrido en levaduras se demostró que TczAC dimeriza a través de su dominio catalítico y se identificaron 13 clones capaces de interaccionar específicamente con la misma. En particular se analizó la interacción de TczAC con el clon correspondiente a la proteína de flagelo paraflagellar rod. Asimismo, TczAC fire expresada en una cepa mutante de levaduras S. pombe. Los resultados obtenidos con estos experimentos sugieren que este sistema de expresión podría ser de gran utilidad para la búsqueda de inhibidores específicos. Por otra parte, se identificó y caracterizó el gen TczPDE que codifica para la primer fosfodiesterasa de AMPc de T. cruzi. Se determinó que este gen es parte de una familia multigénica y codifica para una proteína que presenta un posible péptido señal, dos dominios GAF de unión a GMPc y un dominio catalítico altamente conservado. La funcionalidad de esta proteína se confirmó por ensayos de complementación en levaduras carentes de actividad fosfodiesterasa. En dichas levaduras TczPDE se encontró asociada a la fracción particulada, mostró una alta afinidad por el AMPc y no fue capaz de hidrolizar GMPc. Por ensayos de Western blot se confirmó la asociación de TczPDE a la membrana de las levaduras y se observó que esta se encuentra fuertemente asociada a la misma. La localización subcelular de TczPDE en T. cruzi se estudió por fraccionamiento subcelular e inmunolocalización. Estos experimentos demostraron que TczPDE se encuentra localizada en la membrana plasmática del parásito y concentrada en el flagelo.
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Por otro lado, el Ca+2 estimula la actividad de la misma manera independiente de calmodulina. Utilizando la técnica de doble híbrido en levaduras se demostró que TczAC dimeriza a través de su dominio catalítico y se identificaron 13 clones capaces de interaccionar específicamente con la misma. En particular se analizó la interacción de TczAC con el clon correspondiente a la proteína de flagelo paraflagellar rod. Asimismo, TczAC fire expresada en una cepa mutante de levaduras S. pombe. Los resultados obtenidos con estos experimentos sugieren que este sistema de expresión podría ser de gran utilidad para la búsqueda de inhibidores específicos. Por otra parte, se identificó y caracterizó el gen TczPDE que codifica para la primer fosfodiesterasa de AMPc de T. cruzi. Se determinó que este gen es parte de una familia multigénica y codifica para una proteína que presenta un posible péptido señal, dos dominios GAF de unión a GMPc y un dominio catalítico altamente conservado. La funcionalidad de esta proteína se confirmó por ensayos de complementación en levaduras carentes de actividad fosfodiesterasa. En dichas levaduras TczPDE se encontró asociada a la fracción particulada, mostró una alta afinidad por el AMPc y no fue capaz de hidrolizar GMPc. Por ensayos de Western blot se confirmó la asociación de TczPDE a la membrana de las levaduras y se observó que esta se encuentra fuertemente asociada a la misma. La localización subcelular de TczPDE en T. cruzi se estudió por fraccionamiento subcelular e inmunolocalización. Estos experimentos demostraron que TczPDE se encuentra localizada en la membrana plasmática del parásito y concentrada en el flagelo. In this work we have characterized TczAC adenylyl cyclase. The gene encodes an enzyme which is highly conserved with the adenylyl cyclase genes identified in other trypanosomatids, is part of a multigene family and is expressed in all the stages of T. cruzi life cycle. The product of this gene is a functional enzyme that can complement a yeast strain deficient in adenylyl cyclase activity. The enzyme is specific for cAMP, has a higher activity in the presence of Mn+2 instead of Mg 2+, and is inhibited by Zn+2 and the P-site inhibitor, 2'-deoxy-3 'AMP. On the other hand, Ca+2 stimulates its activity in a calmodulin independent manner. Using the yeast two-hybrid technique it was demonstrated that TczAC dimerizes through its catalytic domains, and 13 clones that interact with this protein were identified. In particular, the interaction of TczAC with the flagellar protein paraflagellar rod was analyzed. Besides, TczAC was expressed in a S. pombe mutant strain. The results obtain in these experiments suggest that this expression system could be useful for the identification of specific inhibitors. Apart from that, the gene TczPDE that codes for the first cAMP phosphodiesterase of T. cruzi was identified and characterized. It was found that this gene is part of a mutligene family and encodes a protein that presents a putative signal peptide, two GAF domains for cGMP binding and a highly conserved catalytic domain. The functionality of this protein was confirmed by complementation assays in yeasts lacking phosphodiesterase activity. In these yeasts TczPDE was found to be associated to the particulate fraction, showed a high affinity for CAMP and was not able to hydrolyze cGMP. By Western blot analysis, the association of TczPDE to the yeast membrane was confirmed, and it was observed that this enzyme is strongly associated to it. The subcellular localization of TczPDE in T. cruzi was studied by subcellular fractionation and immunolocalization. These experiments demonstrated that TczPDE is localized in the plasma membrane of the parasite and concentrated in the flagellum. Fil: D'Angelo, Maximiliano A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2003 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3565_DAngelo

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