Diseño, caracterización, producción y utilización de vectores virales y plasmídicos para terapia génica del cáncer
La transferencia in vivo del gen de la timidina kinasa del virus herpes-1 seguido por laadministración de la prodroga ganciclovir (HSV-tk/GCV) y su posterior activación in situ,surgió como una estrategia de terapia génica eficaz para el tratamiento de tumoresexperimentales y humanos. Se había demost...
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| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2001
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3412_Berenstein |
| Aporte de: |
| Sumario: | La transferencia in vivo del gen de la timidina kinasa del virus herpes-1 seguido por laadministración de la prodroga ganciclovir (HSV-tk/GCV) y su posterior activación in situ,surgió como una estrategia de terapia génica eficaz para el tratamiento de tumoresexperimentales y humanos. Se había demostrado la existencia de un efecto “bystander” porel cuál las células no modificadas por el gen también eran eliminadas por GCV activado porel gen HSV-tk. Sin embargo, su validez fue cuestionada desde diferentes perpectivas, entreellas el sistema de transferencia y el modelo tumoral utilizado. Dada la disparidad deresultados en diferentes modelos experimentales, construimos un vector retroviralconteniendo el gen de HSV-tk y obtuvimos células productoras de vectores retrovirales (VPC). Utilizando dichas células como fuente de tranferencia génica, estudiamos la eficienciade transducción in vivo en células malignas sobre tres modelos tumorales distintos:melanoma murino B16, melanoma humano IIB-MEL-LES y glioblastoma de rata C6. Enestudios in vitro pudimos observar un efecto bystander sólo en células C6. Los estudios invivo mostraron una inhibición del crecimiento tumoral en los dos modelos de melanomacuando las células eran co-inoculadas con VPC productoras de vectores retrovirales portandoel gen HSV-tk (VPC-tk) y tratadas con GCV. Sin embargo, el 100% de los animales fue capazde desarrollar tumores en ambos modelos . Bajo las mismas condiciones experimentales, 70% de las ratas fueron capaces de rechazar células de glioma C6 transferidas de modointracraneal por técnicas estereótaxicas y el 50% de los animales mostró un aumentosignificativoen el tiempo de sobrevida. El tratamiento de tumores C6 establecidos con VPC-tky GCV, llevó a la cura del 33% de los animales. Las ratas que rechazaron el tumorprimario fueron capaces de desarrollar una respuesta inmune de memoria que lleva alrechazo de desafíos contralaterales con células parentales. A los efectos de aumentar el efectoterapéutico estudiamos el efecto antitumoral de la tranferencia del gen de interleuquina-12solo o en combinación con el gen HSV-tk y tratamiento con GCV, sobre tumores de cerebrointracraneales y los mecanismos involucrados en el rechazo tumoral. Luego de latransferencia i.c.de células productoras VPC-IL12, se lograba suprimir el crecimiento detumores C6, aún en tumores establecidos de 10 días. La combinación con células VPC-tk y GCV tuvo mejor efecto terapéutico que los dos tratamientos por separado sobre tumoresincipientes. Los estudios de los mecanismos asociados a la respuesta antitumoraldemostraron la participación de eventos inmunológicos y no inmunológicos. Seccioneshistológicas de cerebros con expresión local de IL-12 mostraron una activación inmediata demacrófagos/microglia y su reclutamiento a áreas intratumorales. La expresión de IL-12también fue capaz de estimular un reclutamiento de PMN e inducir necrosis de vasos tumorales, mientras los vasos del parénquima normal no se vieron afectados. Por otro lado,el tratamiento con HSV-tk/GCV mostró un infiltrado mayoritario de células CD5+. Además,únicamente la combinación de IL-12 y HSV-tk/GCV fue capaz de reclutar células CD4+ y CD8+ cuando el tratamiento era aplicado a tumores de gran tamaño. Los animalessobrevivientes desarrollaron una inflamación crónica en el sitio de inyección primariocompuesto de macrófagos y linfocitos en distintas proporciones según el tipo de terapiainicial aplicado. Este infiltrado crónico no fue perjudicial para el cerebro ya que no seobservaron evidencias de desmielinización ni tampoco daños neurológicos asociados. Por lotanto este estudio provee las bases para comprender los mecanismos involucrados en larespuesta antitumoral inducida por IL-12, sola o en combinación con el sistema del gensuicida y apoya el uso de la terapia combinada para el tratamiento de tumores de cerebro. Un clon de VPC terapéutico portando el gen de HSV-tk fue también seleccionado para suutilización en protocolos clínicos. Este clon mostró una mayor eficacia antitumoral que lapreparación original. Finalmente, se construyeron y caracterizaron nuevos vectores para su uso en terapia génica,basados en sistemas regulables e inducibles por condiciones exógenas (tetraciclina) yendógenas del tumor (hipoxia tumoral). |
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