Diseño, caracterización, producción y utilización de vectores virales y plasmídicos para terapia génica del cáncer

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La transferencia in vivo del gen de la timidina kinasa del virus herpes-1 seguido por laadministración de la prodroga ganciclovir (HSV-tk/GCV) y su posterior activación in situ,surgió como una estrategia de terapia génica eficaz para el tratamiento de tumoresexperimentales y humanos. Se había demost...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Berenstein, Mariana G.
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2001
Materias:
TERAPIA GENICA
TIMIDINA KINASA DEL VIRUS HERPES (HSV-TK)
INTERLEUQUINA-12
CANCER
TUMORES DE CEREBRO
TETRACICLINA
HIPOXIA
GENE THERAPY
HERPES SIMPLEX VIRUS THYMIDINE KINASE
INTERLEUKIN-12
BRAIN NEOPLASM
TETRACYCLINE
HYPOXIA
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3412_Berenstein
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La transferencia in vivo del gen de la timidina kinasa del virus herpes-1 seguido por laadministración de la prodroga ganciclovir (HSV-tk/GCV) y su posterior activación in situ,surgió como una estrategia de terapia génica eficaz para el tratamiento de tumoresexperimentales y humanos. Se había demostrado la existencia de un efecto “bystander” porel cuál las células no modificadas por el gen también eran eliminadas por GCV activado porel gen HSV-tk. Sin embargo, su validez fue cuestionada desde diferentes perpectivas, entreellas el sistema de transferencia y el modelo tumoral utilizado. Dada la disparidad deresultados en diferentes modelos experimentales, construimos un vector retroviralconteniendo el gen de HSV-tk y obtuvimos células productoras de vectores retrovirales (VPC). Utilizando dichas células como fuente de tranferencia génica, estudiamos la eficienciade transducción in vivo en células malignas sobre tres modelos tumorales distintos:melanoma murino B16, melanoma humano IIB-MEL-LES y glioblastoma de rata C6. Enestudios in vitro pudimos observar un efecto bystander sólo en células C6. Los estudios invivo mostraron una inhibición del crecimiento tumoral en los dos modelos de melanomacuando las células eran co-inoculadas con VPC productoras de vectores retrovirales portandoel gen HSV-tk (VPC-tk) y tratadas con GCV. Sin embargo, el 100% de los animales fue capazde desarrollar tumores en ambos modelos . Bajo las mismas condiciones experimentales, 70% de las ratas fueron capaces de rechazar células de glioma C6 transferidas de modointracraneal por técnicas estereótaxicas y el 50% de los animales mostró un aumentosignificativoen el tiempo de sobrevida. El tratamiento de tumores C6 establecidos con VPC-tky GCV, llevó a la cura del 33% de los animales. Las ratas que rechazaron el tumorprimario fueron capaces de desarrollar una respuesta inmune de memoria que lleva alrechazo de desafíos contralaterales con células parentales. A los efectos de aumentar el efectoterapéutico estudiamos el efecto antitumoral de la tranferencia del gen de interleuquina-12solo o en combinación con el gen HSV-tk y tratamiento con GCV, sobre tumores de cerebrointracraneales y los mecanismos involucrados en el rechazo tumoral. Luego de latransferencia i.c.de células productoras VPC-IL12, se lograba suprimir el crecimiento detumores C6, aún en tumores establecidos de 10 días. La combinación con células VPC-tk y GCV tuvo mejor efecto terapéutico que los dos tratamientos por separado sobre tumoresincipientes. Los estudios de los mecanismos asociados a la respuesta antitumoraldemostraron la participación de eventos inmunológicos y no inmunológicos. Seccioneshistológicas de cerebros con expresión local de IL-12 mostraron una activación inmediata demacrófagos/microglia y su reclutamiento a áreas intratumorales. La expresión de IL-12también fue capaz de estimular un reclutamiento de PMN e inducir necrosis de vasos tumorales, mientras los vasos del parénquima normal no se vieron afectados. Por otro lado,el tratamiento con HSV-tk/GCV mostró un infiltrado mayoritario de células CD5+. Además,únicamente la combinación de IL-12 y HSV-tk/GCV fue capaz de reclutar células CD4+ y CD8+ cuando el tratamiento era aplicado a tumores de gran tamaño. Los animalessobrevivientes desarrollaron una inflamación crónica en el sitio de inyección primariocompuesto de macrófagos y linfocitos en distintas proporciones según el tipo de terapiainicial aplicado. Este infiltrado crónico no fue perjudicial para el cerebro ya que no seobservaron evidencias de desmielinización ni tampoco daños neurológicos asociados. Por lotanto este estudio provee las bases para comprender los mecanismos involucrados en larespuesta antitumoral inducida por IL-12, sola o en combinación con el sistema del gensuicida y apoya el uso de la terapia combinada para el tratamiento de tumores de cerebro. Un clon de VPC terapéutico portando el gen de HSV-tk fue también seleccionado para suutilización en protocolos clínicos. Este clon mostró una mayor eficacia antitumoral que lapreparación original. Finalmente, se construyeron y caracterizaron nuevos vectores para su uso en terapia génica,basados en sistemas regulables e inducibles por condiciones exógenas (tetraciclina) yendógenas del tumor (hipoxia tumoral).
format Tesis Doctoral
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Sin embargo, su validez fue cuestionada desde diferentes perpectivas, entreellas el sistema de transferencia y el modelo tumoral utilizado. Dada la disparidad deresultados en diferentes modelos experimentales, construimos un vector retroviralconteniendo el gen de HSV-tk y obtuvimos células productoras de vectores retrovirales (VPC). Utilizando dichas células como fuente de tranferencia génica, estudiamos la eficienciade transducción in vivo en células malignas sobre tres modelos tumorales distintos:melanoma murino B16, melanoma humano IIB-MEL-LES y glioblastoma de rata C6. Enestudios in vitro pudimos observar un efecto bystander sólo en células C6. Los estudios invivo mostraron una inhibición del crecimiento tumoral en los dos modelos de melanomacuando las células eran co-inoculadas con VPC productoras de vectores retrovirales portandoel gen HSV-tk (VPC-tk) y tratadas con GCV. Sin embargo, el 100% de los animales fue capazde desarrollar tumores en ambos modelos . Bajo las mismas condiciones experimentales, 70% de las ratas fueron capaces de rechazar células de glioma C6 transferidas de modointracraneal por técnicas estereótaxicas y el 50% de los animales mostró un aumentosignificativoen el tiempo de sobrevida. El tratamiento de tumores C6 establecidos con VPC-tky GCV, llevó a la cura del 33% de los animales. Las ratas que rechazaron el tumorprimario fueron capaces de desarrollar una respuesta inmune de memoria que lleva alrechazo de desafíos contralaterales con células parentales. A los efectos de aumentar el efectoterapéutico estudiamos el efecto antitumoral de la tranferencia del gen de interleuquina-12solo o en combinación con el gen HSV-tk y tratamiento con GCV, sobre tumores de cerebrointracraneales y los mecanismos involucrados en el rechazo tumoral. Luego de latransferencia i.c.de células productoras VPC-IL12, se lograba suprimir el crecimiento detumores C6, aún en tumores establecidos de 10 días. La combinación con células VPC-tk y GCV tuvo mejor efecto terapéutico que los dos tratamientos por separado sobre tumoresincipientes. Los estudios de los mecanismos asociados a la respuesta antitumoraldemostraron la participación de eventos inmunológicos y no inmunológicos. Seccioneshistológicas de cerebros con expresión local de IL-12 mostraron una activación inmediata demacrófagos/microglia y su reclutamiento a áreas intratumorales. La expresión de IL-12también fue capaz de estimular un reclutamiento de PMN e inducir necrosis de vasos tumorales, mientras los vasos del parénquima normal no se vieron afectados. Por otro lado,el tratamiento con HSV-tk/GCV mostró un infiltrado mayoritario de células CD5+. Además,únicamente la combinación de IL-12 y HSV-tk/GCV fue capaz de reclutar células CD4+ y CD8+ cuando el tratamiento era aplicado a tumores de gran tamaño. Los animalessobrevivientes desarrollaron una inflamación crónica en el sitio de inyección primariocompuesto de macrófagos y linfocitos en distintas proporciones según el tipo de terapiainicial aplicado. Este infiltrado crónico no fue perjudicial para el cerebro ya que no seobservaron evidencias de desmielinización ni tampoco daños neurológicos asociados. Por lotanto este estudio provee las bases para comprender los mecanismos involucrados en larespuesta antitumoral inducida por IL-12, sola o en combinación con el sistema del gensuicida y apoya el uso de la terapia combinada para el tratamiento de tumores de cerebro. Un clon de VPC terapéutico portando el gen de HSV-tk fue también seleccionado para suutilización en protocolos clínicos. Este clon mostró una mayor eficacia antitumoral que lapreparación original. Finalmente, se construyeron y caracterizaron nuevos vectores para su uso en terapia génica,basados en sistemas regulables e inducibles por condiciones exógenas (tetraciclina) yendógenas del tumor (hipoxia tumoral). In vivo transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene followed by gancicloviradministration (HSV-tk/GCV) and in situ activation of the prodrug, has evolved as an effectiveapproach to the treatment of tumors of experimental and human origin. In vitro studies wereable to demonstrate the development of a“bystander effect" that led to the death of cells thatdo not express the gene, in the presence of GCV activated by HSV-tk modified cells. However, several studies have questioned the validity of this approach, mainly in terms of thegene transfer system being used and the experimental model to which they applied. Considering the different results that were reported on different experimental tumor models,we made a retroviral vector containing the HSV-tk gene and retroviral vector producer cells (VPC) were obtained. By using these (VPC) as a source for in vivo gene transfer we evaluatedthe efficacy of in vivo transduction of malignant cells using three different tumor cell models: 816 murine and IIB-MEL-LES human melanomas, and C6 rat glioblastoma. In vitro studieshave shown a bystander effect only in C6 cells. In vivo studies showed an inhibition of tumorgrowth in the two melanoma models when tumor cells were co-injected with VPC producingretroviral vectors carrying the HSV-tk gene (VPC-tk), followed by GCV treatment, but 100% ofmice developed tumors in both models. Under similar experimental conditions, 70% ofsyngeneic rats completely rejected stereotactically transferred C6 tumor cells and 50% of themshowed a prolonged_survival. Treatment of established C6 tumors with VPC-tk and GCV led tocure of 33% of the animals. Rats which rejected tumor growth developed an anti-tumorimmune memory leading to rejection of a stereotactic contralateral challenge with parentalcells. In order to increase the therapeutic efficacy of the system we studied the antitumoralresponse after interleukin-12 (IL-12) gene transfer alone or in combination with the herpesvirus thymidine kinase gene/gancyclovir (HSVtk/GCV), on i.c. implanted brain tumors and theunderlying mechanisms mediating tumor rejection. Following i.c. transplantation of retroviralvector producer cells (VPC) VPC-IL12 were able to suppress rat C6 glioma tumor growth evenwhen rats carried 10 days-old tumors. Its combination with VPC-tk had better therapeuticeffect than each single treatment on incipient tumors. The study of the mechanisms involved inthe antitumoral response, clearly showed that it was mediated by immune and no immunemechanisms. IL-12 expression was characterized by the immediate activation ofmicroglia/macrophage and their recruitment to the intratumoral area. IL-12 expression alsostimulated PMN recruitment and induced tumor vessel necrosis, while normal brain vesselsremained intact. Conversely, CD5+ lymphocytes were the main immune cell type recruited by HSV-tk/GCV. In addition, only the combination of IL-12 and HSV-tk/GCV was able to recruit CD4+ and CD8+ when large tumors were treated. Surviving rats developed a chronicinflammation at the site of injection composed of macrophages and lymphocytes which wasnot harmful to the brain since no demielynization or neurological signs were observed. Thepresent study provides a basis to understand the mechanisms underlying the antitumorresponse induced by IL-12 alone and in combination with HSV-tk/GCV and supports their usein combination therapy of brain tumors We also selected a therapeutic clone of VPC carrying the HSV-tk gene for its clinicalapplication. This clone showed a higher antitumor efficacy than the original cell preparation. Finally, new gene therapy vectors, based on systems regulated by exogenous (tetracycline)and endogenous (tumor hypoxia) conditions, were developed and further characterized Fil: Berenstein, Mariana G.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2001 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3412_Berenstein

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