Expresión de genes asociados a fibrosis quística

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La Fibrosis Quística es la más frecuente de las enfermedades humanas severas, de origen genético, en la población caucásica (Welsh MJ, 1995). Se produce por mutaciones en un único gen, que codifica para el canal de Cl- CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Kerem et al., 1989; Ri...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	González Guerrico, Anatilde María
Formato:	Tesis Doctoral
Lenguaje:	Español
Publicado:	2001
Materias:	FIBROSIS QUISTICA CFTR IL-1BETA PKC PROTEINA QUINASA DE TIROSINA NFKB C-JUN C-FOS C-SRC MUCINAS MUC1 PSEUDOMONAS AURUGINOSA CYSTIC FIBROSIS DIFFERENTIAL DISPLAY TIROSINE-KINASES NF-KB MUCINS MUCI PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3322_GonzalezGuerrico
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	La Fibrosis Quística es la más frecuente de las enfermedades humanas severas, de origen genético, en la población caucásica (Welsh MJ, 1995). Se produce por mutaciones en un único gen, que codifica para el canal de Cl- CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Aún no ha sido establecida una relación clara entre el defecto genético y los mecanismos que gobiernan esta enfermedad. Todas las citoquinas proinflamatorias que han sido estudiadas en el ambiente inflamatorio de los pulmones FQ [factor de necrosis tumoral (TNF-α), interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-6 (IL-6) e interleuquina-8 (IL-8)] están elevadas y la concentración de la citoquina antinflamatoria interleuquina-10 (IL-10) está considerablemente reducida (Khan et al., 1995). A su vez, la IL-1β regula la expresión del CFTR (Cafferata E G A, 2001; Cafferata et al., 2000). Por otro lado, las proteínas proinflamatorias TNF-α, IL-1β y IL-6 regulan positivamente los genes de las mucinas muc2 y muc5 (Dohrman et al., 1998) e incrementan la quimioatracción de neutrófilos (Ohishi, 2000) que liberan gran cantidad de proteínas, especies reactivas de oxígeno y NO, que pueden causar daño celular. Entonces, es posible que genes diferencialmente regulados por IL-1β tengan una participación en los mecanismos que llevan a la muerte celular, la exacerbación de los procesos inflamatorios o la acumulación de mucinas en el tracto respiratorio FQ. Con el fin de identificar nuevos intermediarios en la vía de señalización de IL-1β, o de identificar genes que tuviesen una regulación similar al CFTR, se realizó un "Differential Display" sobre las células T84 tratadas con distintas concentraciones de IL-1β. Se aisló un gen regulado por dicha citoquina, que poseía el mismo patrón de modulación que el CFTR. La banda aislada fue clonada y secuenciada. La misma mostró una homología del 99% con otras del banco de datos que codificaban para proteínas cuya actividad es desconocida. A este gen diferencial se lo denominó hsccl (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). Por el análisis de la secuencia completa del ARNm se determinó que hscc1 contiene dominios que se hallan conservados en la familia de las proteínas transportadoras. Mediante "Northern blots" se observó una doble banda correspondiente a 3,5 kb, que mostraba un máximo de activación cuando las células fueron tratadas con 0,5 ng/ ml de IL-1β. Por otro lado, la expresión de hscc1 se inhibió a concentraciones de IL-1β mayores a 1 ng/ml. La IL-1β induce al factor de transcripción NF-κB cuando se encuentra presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,5 ng/ml (Cafferata E G A, 2001), mientras que con 2,5 ng/ml de IL-1β se inducen los factores c-jun y c-fos, pero no NF-κB. Usando un virus que sobre-expresa a un dominante negativo de NF-κB, se determinó que la inducción de este factor es necesaria para que se produzca el aumento en la expresión de hscc1 por IL-1β, en forma similar a lo que ocurre con CFTR. Por otro lado, el inhibidor de proteína quinasa C, GF109203X (Battle et al., 1998) y los inhibidores de proteína quinasas de tirosina Genisteína (Rao et al., 1997) y Herbimicina A (Taylor et al., 1997), bloquearon la inducción mediada por IL-1β, sugiriendo que estas proteína quinasas estan también involucradas en el camino de transducción de la señal de IL-1β. Otro objetivo de este trabajo fue identificar genes cuya expresión fuese dependiente de la actividad del CFTR, con el fin de determinar cuales eran las funciones celulares dependientes del canal CFTR y de identificar factores que contribuyesen a la deficiencia pulmonar en fibrosis quística. Realizamos un "Differencial Display" usando células de epitelio de traquea fibroquística (CFDE) y las mismas células transfectadas con el CFTR normal (CFDE/6RepCFTR). Aislamos e identificamos un ARNm de expresión diferencial que codifica para la quinasa de tirosina c-Src. Este mensajero se encontró sobre-expresado en las células CFDE. Cuando las células CFDE/6RepCFTR fueron tratadas con el inhibidor del canal CFTR NPPB, los niveles del ARNm c-Src se elevaron. Es decir, la actividad del canal CFTR sería necesaria para la regulación de c-src. Asimismo, los análisis de la proteína c-Src por inmunohistoquímica mostraron que ésta se encuentra elevada en los pulmones FQ. La fibrosis quística se caracteriza por la acumulación de mucus que obstruye los conductos de distintos órganos (Hutchison and Govan, 1999). A su vez, este aumento en la producción de mucinas puede hacer a los enfermos más susceptibles de sufrir infecciones pulmonares por Pseudomonas aeruginosa (Parmley and Gendler, 1998). Se sabe que MUC1 se encuentra elevada en el colon de los ratones FQ, pero los ratones FQ que no producen MUC1 (ratones "knock out" para MUC1) tienen una obstrucción intestinal mucho menor. Además, a c-Src se la ha involucrado en la producción de mucinas en respuesta a diversas injurias (Bausbaum et al., 1999). Era posible entonces que el aumento de c-Src inducido por la falla en CFTR fuese responsable de la acumulación de mucus. Para corroborar esta hipótesis, se midió la expresión de la MUC1. Esta fue encontrada elevada en células CFDE respecto de las células CFDE/6RepCFTR. Además, cuando las células CFDE fueron tratadas con un dominante negativo o con un inhibidor de c-Src (PP2) los niveles de MUC1 disminuyeron. Estos resultados indican que c-Src estaría involucrada en el camino de señalización que lleva el aumento de MUC1. Estos datos sugieren, además, que la falla en el CFTR produciría un incremento en la expresión de MUC1 en el sistema respiratorio y que esto ocurre previamente a la infección pulmonar. En consecuencia, la quinasa c-Src podría ser el nexo entre la falla del CFTR y la acumulación de mucinas en fibrosis quística.
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spelling	todo:tesis_n3322_GonzalezGuerrico2023-10-03T12:38:46Z Expresión de genes asociados a fibrosis quística Gene expresion of cystic fibrosis associates genes González Guerrico, Anatilde María FIBROSIS QUISTICA CFTR IL-1BETA PKC PROTEINA QUINASA DE TIROSINA NFKB C-JUN C-FOS C-SRC MUCINAS MUC1 PSEUDOMONAS AURUGINOSA CYSTIC FIBROSIS CFTR DIFFERENTIAL DISPLAY IL-1BETA PKC TIROSINE-KINASES NF-KB C-JUN C-SRC MUCINS MUCI PSEUDOMONAS AERUGINOSA La Fibrosis Quística es la más frecuente de las enfermedades humanas severas, de origen genético, en la población caucásica (Welsh MJ, 1995). Se produce por mutaciones en un único gen, que codifica para el canal de Cl- CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Aún no ha sido establecida una relación clara entre el defecto genético y los mecanismos que gobiernan esta enfermedad. Todas las citoquinas proinflamatorias que han sido estudiadas en el ambiente inflamatorio de los pulmones FQ [factor de necrosis tumoral (TNF-α), interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-6 (IL-6) e interleuquina-8 (IL-8)] están elevadas y la concentración de la citoquina antinflamatoria interleuquina-10 (IL-10) está considerablemente reducida (Khan et al., 1995). A su vez, la IL-1β regula la expresión del CFTR (Cafferata E G A, 2001; Cafferata et al., 2000). Por otro lado, las proteínas proinflamatorias TNF-α, IL-1β y IL-6 regulan positivamente los genes de las mucinas muc2 y muc5 (Dohrman et al., 1998) e incrementan la quimioatracción de neutrófilos (Ohishi, 2000) que liberan gran cantidad de proteínas, especies reactivas de oxígeno y NO, que pueden causar daño celular. Entonces, es posible que genes diferencialmente regulados por IL-1β tengan una participación en los mecanismos que llevan a la muerte celular, la exacerbación de los procesos inflamatorios o la acumulación de mucinas en el tracto respiratorio FQ. Con el fin de identificar nuevos intermediarios en la vía de señalización de IL-1β, o de identificar genes que tuviesen una regulación similar al CFTR, se realizó un "Differential Display" sobre las células T84 tratadas con distintas concentraciones de IL-1β. Se aisló un gen regulado por dicha citoquina, que poseía el mismo patrón de modulación que el CFTR. La banda aislada fue clonada y secuenciada. La misma mostró una homología del 99% con otras del banco de datos que codificaban para proteínas cuya actividad es desconocida. A este gen diferencial se lo denominó hsccl (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). Por el análisis de la secuencia completa del ARNm se determinó que hscc1 contiene dominios que se hallan conservados en la familia de las proteínas transportadoras. Mediante "Northern blots" se observó una doble banda correspondiente a 3,5 kb, que mostraba un máximo de activación cuando las células fueron tratadas con 0,5 ng/ ml de IL-1β. Por otro lado, la expresión de hscc1 se inhibió a concentraciones de IL-1β mayores a 1 ng/ml. La IL-1β induce al factor de transcripción NF-κB cuando se encuentra presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,5 ng/ml (Cafferata E G A, 2001), mientras que con 2,5 ng/ml de IL-1β se inducen los factores c-jun y c-fos, pero no NF-κB. Usando un virus que sobre-expresa a un dominante negativo de NF-κB, se determinó que la inducción de este factor es necesaria para que se produzca el aumento en la expresión de hscc1 por IL-1β, en forma similar a lo que ocurre con CFTR. Por otro lado, el inhibidor de proteína quinasa C, GF109203X (Battle et al., 1998) y los inhibidores de proteína quinasas de tirosina Genisteína (Rao et al., 1997) y Herbimicina A (Taylor et al., 1997), bloquearon la inducción mediada por IL-1β, sugiriendo que estas proteína quinasas estan también involucradas en el camino de transducción de la señal de IL-1β. Otro objetivo de este trabajo fue identificar genes cuya expresión fuese dependiente de la actividad del CFTR, con el fin de determinar cuales eran las funciones celulares dependientes del canal CFTR y de identificar factores que contribuyesen a la deficiencia pulmonar en fibrosis quística. Realizamos un "Differencial Display" usando células de epitelio de traquea fibroquística (CFDE) y las mismas células transfectadas con el CFTR normal (CFDE/6RepCFTR). Aislamos e identificamos un ARNm de expresión diferencial que codifica para la quinasa de tirosina c-Src. Este mensajero se encontró sobre-expresado en las células CFDE. Cuando las células CFDE/6RepCFTR fueron tratadas con el inhibidor del canal CFTR NPPB, los niveles del ARNm c-Src se elevaron. Es decir, la actividad del canal CFTR sería necesaria para la regulación de c-src. Asimismo, los análisis de la proteína c-Src por inmunohistoquímica mostraron que ésta se encuentra elevada en los pulmones FQ. La fibrosis quística se caracteriza por la acumulación de mucus que obstruye los conductos de distintos órganos (Hutchison and Govan, 1999). A su vez, este aumento en la producción de mucinas puede hacer a los enfermos más susceptibles de sufrir infecciones pulmonares por Pseudomonas aeruginosa (Parmley and Gendler, 1998). Se sabe que MUC1 se encuentra elevada en el colon de los ratones FQ, pero los ratones FQ que no producen MUC1 (ratones "knock out" para MUC1) tienen una obstrucción intestinal mucho menor. Además, a c-Src se la ha involucrado en la producción de mucinas en respuesta a diversas injurias (Bausbaum et al., 1999). Era posible entonces que el aumento de c-Src inducido por la falla en CFTR fuese responsable de la acumulación de mucus. Para corroborar esta hipótesis, se midió la expresión de la MUC1. Esta fue encontrada elevada en células CFDE respecto de las células CFDE/6RepCFTR. Además, cuando las células CFDE fueron tratadas con un dominante negativo o con un inhibidor de c-Src (PP2) los niveles de MUC1 disminuyeron. Estos resultados indican que c-Src estaría involucrada en el camino de señalización que lleva el aumento de MUC1. Estos datos sugieren, además, que la falla en el CFTR produciría un incremento en la expresión de MUC1 en el sistema respiratorio y que esto ocurre previamente a la infección pulmonar. En consecuencia, la quinasa c-Src podría ser el nexo entre la falla del CFTR y la acumulación de mucinas en fibrosis quística. Cystic Fibrosis (CF) is the most important severe genetic in Caucasian population (Welsh MJ, 1995). It is caused by mutations in a single gene that codifies for the chloride channel named cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). A clear relationship between the genetic defect and the mechanisms governing the disease has not been fully established. In the inflammatory medium of CF lung every pro-inflammatory cytokines tested [tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 1 (IL-1), interleukin-8 (IL-8) and interleukin-6 (IL-6)] were elevated and the concentration of anti-inflammatory cytokine interleukin-10 (IL-10) was considerably decreased. In addition, IL-1β regulates CFTR expression. In this work, a differential display from T84 cells treated with different concentrations of IL-1β was performed, in order to identify new second messengers of IL-1β signaling pathway or other genes that have a regulation similar to cftr. The proinflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 up-regulate muc2 and muc5 gene expression (Dohrman et al., 1998) and increase neutrophils chemioattraction (Ohishi, 2000), which produce proteins, NO, and oxygen reactive molecules that can cause cellular injure; then, IL-1β differential expressed genes may be involved in processes that produce cell died, inflammation exacerbation or mucus accumulation in the CF airway. One of the differential display isolated fragments was cloned and sequenced. The sequence showed 99% homology with other sequences present in the data bank. They codify for proteins with unknown activity. This differential expressed gene was called hscc1 (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). The complete hscc1 mRNA sequence analysis predicted that HSCC1 sheared some conserved domains with transport proteins. Northern blots assays, using 32P labeled hscc1 as a probe, a double band of 3,7 kbp was observed. Maximum mRNA levels were obtained after treating the cells with 0.5 ng/ml of IL-1β. Hscc1 expression was inhibited with 1 ng/ml or higher concentrations of IL-1β. On the other hand, IL-1β at 0.5 ng/ml induced the transcription factor NF-ĸB (Cafferata E G A, 2001) but 2.5 ng/ml of this cytokine induced c-jun and c-fos but not NF-ĸB. In this work it was determinated that NF-ĸB is essential for the IL-1β induction of hscc1 by using a NF-ĸB dominant negative expressing virus. The pre-treatment with PKC inhibitor GF109203X (Batlle et al., 1997) blocked the IL-1β induction of hscc1, suggesting that these protein-kinases are involved in the IL-1 signal transduction pathway. In order to better understand which cellular functions depend on CFTR channel activity and which factors contribute to the pulmonary defects in cystic fibrosis, we search for possible genes having a CFTR-dependent expression. We performed a differential display assay using human CF tracheal epithelial cells (CFDE) and the same cells transfected with normal CFTR (CFDE/6RepCFTR). We have isolated and identified the tyrosine kinase c-Src as a differential gene, which was up-regulated in CFDE cells. When CFDE/6RepCFTR cells were treated with the CFTR channel inhibitor, NPPB, the levels of the c-Src mRNA raised, suggesting that the chloride channel activity should be involved in CFTR-dependent regulation of c-Src expression. In addition, immuno-histochemical analysis showed and increased c-Src in the CF lung. The most important problem in cystic fibrosis results from obstruction of ducts in several organs due to excessive mucus secretion (Hutchison and Govan, 1999). The overexpression of mucins in turn might lead to susceptibility to Pseudomonas aeruginosa infection in cases of CF (Basbaum et al., 1999). The expression of the mucin MUC1 is elevated in the colon of CF mouse, and CF mouse lacking MUC1 exhibits greatly diminished intestinal mucus obstruction (Parmley and Gendler, 1998). In addition, c-Src has been involved in mucin production in response to diverse insults (Basbaum et al., 1999). Therefore, we studied the possible role of c-Src in mucus accumulation due to the CFTR failure. We found taht MUC1 was elevated in the tracheal CFDE cells compared with CFDE/6RepCFTR cells. When CFDE cells were treated with a c-Src dominant negative plasmid or the c-Src inhibitor PP2, the MUC1 levels diminished, suggesting that c-Src might be involved in the signalling pathway that drives the elevation of MUC1 in CF. These data suggest that the CFTR failure produce an elevated MUC1 expression in the airway and this occurs previously to lung infection. Therefore, the tyrosine kinase c-Src seems to constitute a bridge between MUC1 over-expression and the CFTR channel failure. Fil: González Guerrico, Anatilde María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2001 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3322_GonzalezGuerrico

Expresión de genes asociados a fibrosis quística

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