Caracterización bioquímica y molecular de la enzima UDP-glucosa : proteína transglucosilasa de Solanum tuberosum

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La enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa (UPTG) es una glicosiltransferasaautocatalítica descripta inicialmente en tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.). Se habíapropuesto que la UPTG era capaz de iniciar la síntesis de α-glucanos unidos a proteína in vitroy que tendría una función de pro...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Bocca, Silvia N.
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 1998
Materias:
ALMIDON
GLICOSILTRANSFERASA
GOLGI
POLISACARIDOS
SOLANUM TUBEROSUM L.
UDP-GLUCOSA: PROTEINA TRANSGLUCOSILASA
GLYCOSYLTRANSFERASE
POLYSACCHARIDE
STARCH
UDP-GLUCOSE: PROTEIN TRANSGLUCOSYLASE
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3073_Bocca
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa (UPTG) es una glicosiltransferasaautocatalítica descripta inicialmente en tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.). Se habíapropuesto que la UPTG era capaz de iniciar la síntesis de α-glucanos unidos a proteína in vitroy que tendría una función de proteína iniciadora de la biosíntesis del almidón. La UPTG detubérculo de papa se purificó hasta aparente homogeneidad, se desarrollaron anticuerpospoliclonales específicos contra la misma y se clonaron cADNs correspondientes a la UPTG porscreening de genotecas de expresión de papa. Ensayos de Northern blot y Western blotmostraron que tanto el ARN mensajero como la proteína UPTG están presentes en un nivelsemejante en todos los tejidos de la planta. Algunas de las secuencias clonadas se expresaron en E. coli obteniéndose UPTG recombinante enzimáticamente activa. Se encontró que tanto lasproteínas recombinantes como la purificada de tubérculo pueden ser glicosiladas a partir de UDP-Glc, UDP-Xil o UDP-Gal y que la glicosilación es reversible. Dos cADNs obtenidosfueron secuenciados totalmente, esto permitió detectar un muy alto grado de identidad (~ 90%)entre la secuencia de la UPTG y varias secuencias de proteínas vegetales de función aún nodeterminada que localizan específicamente en la región trans del aparato de Golgi. La secuenciade la UPTG no presenta zonas hidrofóbicas que puedan corresponder a regiones transmembranani un posible péptido señal que permita su entrada a plástidos o al sistema de endomembranasde la célula. Estos resultados sugieren que la enzima localizaría en el lado citoplásmico delaparato de Golgi y no en los plástidos en donde ocurre la síntesis del almidón, por lo tanto estánen contra de un posible rol de la UPTG en la síntesis de este polisacárido. En ningún organismoque no sea vegetal se encontró una proteína que pueda considerarse homóloga a la UPTG. Estacaracterística, sumada a su localización indicarían una posible función relacionada con la síntesisde los polisacáridos complejos de la pared, función exclusiva del aparato de Golgi de las célulasvegetales. La especificidad de la UPTG por distintos nucleótidos azúcares y la reversibilidad dela reacción de glicosilación hacen pensar que la UPTG podría estar formando parte de unsistema complejo que acople el transporte de nucleótidos azúcares con la síntesis depolisacáridos estructurales.
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La UPTG detubérculo de papa se purificó hasta aparente homogeneidad, se desarrollaron anticuerpospoliclonales específicos contra la misma y se clonaron cADNs correspondientes a la UPTG porscreening de genotecas de expresión de papa. Ensayos de Northern blot y Western blotmostraron que tanto el ARN mensajero como la proteína UPTG están presentes en un nivelsemejante en todos los tejidos de la planta. Algunas de las secuencias clonadas se expresaron en E. coli obteniéndose UPTG recombinante enzimáticamente activa. Se encontró que tanto lasproteínas recombinantes como la purificada de tubérculo pueden ser glicosiladas a partir de UDP-Glc, UDP-Xil o UDP-Gal y que la glicosilación es reversible. Dos cADNs obtenidosfueron secuenciados totalmente, esto permitió detectar un muy alto grado de identidad (~ 90%)entre la secuencia de la UPTG y varias secuencias de proteínas vegetales de función aún nodeterminada que localizan específicamente en la región trans del aparato de Golgi. La secuenciade la UPTG no presenta zonas hidrofóbicas que puedan corresponder a regiones transmembranani un posible péptido señal que permita su entrada a plástidos o al sistema de endomembranasde la célula. Estos resultados sugieren que la enzima localizaría en el lado citoplásmico delaparato de Golgi y no en los plástidos en donde ocurre la síntesis del almidón, por lo tanto estánen contra de un posible rol de la UPTG en la síntesis de este polisacárido. En ningún organismoque no sea vegetal se encontró una proteína que pueda considerarse homóloga a la UPTG. Estacaracterística, sumada a su localización indicarían una posible función relacionada con la síntesisde los polisacáridos complejos de la pared, función exclusiva del aparato de Golgi de las célulasvegetales. La especificidad de la UPTG por distintos nucleótidos azúcares y la reversibilidad dela reacción de glicosilación hacen pensar que la UPTG podría estar formando parte de unsistema complejo que acople el transporte de nucleótidos azúcares con la síntesis depolisacáridos estructurales. The enzyme UDP-glucose: protein transglucosylase (UPTG) is an autocatalyticglycosyltransferase reported in potato tuber (Solanum tuberosum L.). It was suggested that UPTG could in vitro initiate protein-bound α-glucan synthesis and postulated as the proteinthat primes starch biosynthesis. UPTG was purified to apparent homogeneity from potatotubers, polyclonal antibodies were raised against the protein and cDNAs coding for UPTG werecloned screening potato expression libraries. RNA hybridization studies and Western blotanalysis indicated that UPTG mRNA and polypeptide are expressed in all potato tissues. Whenthe cloned sequences were expressed in E. coli, the recombinant UPTG was enzymaticallyactive. It was determined that purified as well as recombinant UPTG can be glycosylated by UDP-Glc, UDP-Xyl or UDP-Gal and that glycosylation is reversible. The complete sequence oftwo cDNAs was obtained and compared with the sequences present in the databanks. UPTGshows a high degree of similarity (~ 90%) with several plant sequences. The function of thesesequences remains to be determined but it was demonstrated their specific localization in thetrans-Golgi cisternae. UPTG sequence do not present hydrophobic segments that couldcorrespond to transmembrane regions. The amino terminal sequence lacks a signal peptide thatcould allow the protein to enter into plastids or into endomembrane system of the cell. Theseresults suggest that the enzyme localizes at the cytoplasmic face of the Golgi apparatus, and notin plastids were starch synthesis occurs, and are against a possible role of UPTG in starchsynthesis. In no organism other than plants a sequence homologous to UPTG could bedetected. This fact, added to its Golgi localization suggests a role in cell wall polysaccharidesynthesis, a function present exclusively in the Golgi apparatus of plant cells. The specificity of UPTG for different sugar-nucleotides and the reversibility of the glycosylation mightcorrespond to UPTG being part of a complex system that couples sugar-nucleotide transportwith the synthesis of cell wall polysaccharides. Fil: Bocca, Silvia N.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 1998 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3073_Bocca

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