Sistemas de transporte de aminoácidos neutros en Saccharomyces cerevisiae, cepas silvestres y mutantes transporte-defectivas

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Evidencias cinéticas y genéticas muestran que en Saccharomyces cerevisiae, la incorporación de losaminoácidos de cadena ramificada L-leucina, L-isoleucina y L-valina es mediada por al menos tressistemas funcionalmente distintos: la permeasa general de aminoácidos GAP1 (inactiva en presencia deiones...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Chianelli, Mónica Silvia
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 1998
Materias:
LEVADURA
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
PERMEASA
TRANSPORTE DE AMINOACIDOS
INCORPORACION
L-LEUCINA
L-ISOLEUCINA
L-VALINA
AMINOACIDOS DE CADENA RAMIFICADA
LET1
LET2
TRIFLUORLEUCINA
YEAST
PERMEASE
AMINO ACID TRANSPORT
UPTAKE
L-LEUCINE
L-ISOLEUCINE
L-VALINE
BRANCHED-CHAIN AMINO ACIDS
LET
TRIFLUOROLEUCINE
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3006_Chianelli
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Evidencias cinéticas y genéticas muestran que en Saccharomyces cerevisiae, la incorporación de losaminoácidos de cadena ramificada L-leucina, L-isoleucina y L-valina es mediada por al menos tressistemas funcionalmente distintos: la permeasa general de aminoácidos GAP1 (inactiva en presencia deiones amonio) y dos sistemas de transporte más específicos S1 y S2, previamente descriptos para eltransporte de L-Leucina. En celulas silvestres cultivadas en medio conteniendo L-prolina, cada uno de los aminoácidos decadena ramificada exhibe un solo sistema de transporte de alta afinidad y muy alta capacidad. Unamutante gap1 muestra dos sistemas de transporte para Leucina con valores de KT y Jmáx similares aaquellos descriptos previamente como S1 y S2, y un solo sistema de transporte de baja afinidad- altacapacidad para isoleucina o valina. Una cepa mutante defectiva en los sistemas S1 y S2 quetransportan Leucina fue aislada a partir de la parental ya deficiente en la permeasa general deamingácidos, GAP1. La mutante fue seleccionada como una cepa espontánea resistente a triflúorleucina (TFL). Esta mutante fue cruzada con una cepa testigo gap1, y el análisis de tetradas indicó que laresistencia completa a TFL dependió de la presencia de al menos dos genes mutantes no ligados,denominados let (leucine transport). La mutación let1 inactiva completamente el sistema de transportede Leucina de alta afinidad-baja capacidad definido cinéticamente como S1. Aunque la mutación let2causó una marcada disminución en la Jmax del sistema S2 de baja afinidad, el transporte residual de Leucina en la mutante gap1let1let2 tuvo el mismo KT que el de la cepa parental gap1LET1LET2. Resultados similares se obtuvieron para los únicos sistemas de transporte de isoleucina o valina. Lamutante gap1let1let2 exhibió una marcada disminución en el crecimiento sobre medio minimoconteniendo Leucina, isoleucina o valina como únicas fuentes de nitrógeno. Además, la asimilación demetionina, fenilalanina, serina, treonina y norleucina estuvo impedida severamente, mientras losaminoácidos básicos y ácidos sostuvieron un crecimiento normal. Esto indica que al menos una de laspermeasas de Leucina tiene una considerablemente amplia pero aún limitada especificidad. La reversióndel gen gap1 restauró el transporte de los aminoácidos de cadena ramificada. La cepa revertante fuesensible a TFL cuando creció en prolina, pero resistente cuando amonio fue la fuente de nitrógeno. La segregante (sensible a TFL) gap1let2 exhibió para cada uno de los aminoácidos de cadenaramificada, solamente un sistema de transporte de alta afinidad-baja capacidad. Esta cepa mostróparámetros cinéticos para el transporte de Leucina muy similares a aquellos caracterizados para elsistema S1 en la cepa gap1. Cada uno de los sistemas de transporte de alta afinidad de losaminoácidos de cadena ramificada es inhibido competitivamente por los otros dos aminoácidos decadena ramificada. Además, metionina, norleucina y TFL actúan como inhibidores competitivos deltransporte de Leucina por el sistema de alta afinidad. En la mutante gap1let2 la deficiencia en laactividad de S2 resulta en la perdida de la capacidad de crecer significativamente en medios de cultivoconteniendo treonina, serina y norleucina como únicas fuentes de nitrógeno y un crecimiento reducidosobre los aminoácidos de cadena ramificada individuales, metionina y fenilalanina. Por lo tanto, el gen LET1 codifica la permeasa de L-aminoácidos de cadena ramificada de alta afinidad-baja capacidad S1,y posiblemente transporte también metionina y -fenilalanina. La permeasa LET1 (St) es primariamenteresponsable de la acumulación intracelular de TFL a niveles tóxicos, porque este sistema no esdetectable en la mutante resistente a TFL gap1let1let2. En contraste, la segregante gap1/eN exhibiópara cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada solamente un sistema de transporte de bajaafinidad- alta capacidad. Esta cepa mostró para el transporte de Leucina un valor de KT muy similar aaquel caracterizado para el sistema S2 en la cepa gap1 aunque con un valor de Jmax mas alto. Un únicosistema de transporte de baja afinidad -alta capacidad para isoleucina o valina mostró similarescaracterísticas. Esta cepa crece normalmente como la cepa gap1 sobre todas las fuentes de nitrógenoensayadas. Isoleucina, valina, metionina, alanina y norleucina son inhibidores competitivos deltransporte de Leucina por el sistema S2. Los valores de Ki están en el orden de los valores de KTdeterminados para el transporte de Leucina, isoleucina y valina. DL-TFL es un inhibidor competitivo delsistema S2 pero el valor Kies más grande que el valor de KTpara el transporte de Leucina. Por Io tanto.el sistema S2 de baja afinidad- alta capacidad tiene una relativamente amplia especificidad.transportando no sólo los aminoácidos de cadena ramificada sino también metionina, alanina, serina.treonina y norleucina. Estos resultados sugieren que el gen LET2 codifica un componente asociado a laóptima actividad del sistema S2. La regulación de la actividad de transporte por la fuente de nitrógeno presente en el medio de cultivoindica que la permeasa LET1 (S1) no está sujeta a la represión catabólica por nitrógeno ni a lainactivación catabólica por nitrógeno (NCI). En contraste, en la cepa gap1 la actividad de transporte de L-leucina por S2 es regulada negativamente por los iones amonio. Más aún, en esta condición, eltransporte de L-leucina por el sistema S2 en las cepas gap1 y gap1let1let2 exhibió parámetros Cineticossimilares. En la segregante gap1/en el comportamiento regulatorio fue diferente. Las activdades detransporte de los aminoácidos de cadena ramificada por S2 fueron más altas que aquellas obtenidas enlas células mutantes gap1 o gap1let1let2 crecidas en los medios de cultivo conteniendo L-prolina oiones amonio como únicas fuentes de nitrógeno. Estos resultados sugieren una tercera mutaciónademás de let1 y let2 que podría interferir con la incorporación de los aminoácidos de cadena ramificadao de una interacción entre los productos de los genes LET1 y LET2.
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En celulas silvestres cultivadas en medio conteniendo L-prolina, cada uno de los aminoácidos decadena ramificada exhibe un solo sistema de transporte de alta afinidad y muy alta capacidad. Unamutante gap1 muestra dos sistemas de transporte para Leucina con valores de KT y Jmáx similares aaquellos descriptos previamente como S1 y S2, y un solo sistema de transporte de baja afinidad- altacapacidad para isoleucina o valina. Una cepa mutante defectiva en los sistemas S1 y S2 quetransportan Leucina fue aislada a partir de la parental ya deficiente en la permeasa general deamingácidos, GAP1. La mutante fue seleccionada como una cepa espontánea resistente a triflúorleucina (TFL). Esta mutante fue cruzada con una cepa testigo gap1, y el análisis de tetradas indicó que laresistencia completa a TFL dependió de la presencia de al menos dos genes mutantes no ligados,denominados let (leucine transport). La mutación let1 inactiva completamente el sistema de transportede Leucina de alta afinidad-baja capacidad definido cinéticamente como S1. Aunque la mutación let2causó una marcada disminución en la Jmax del sistema S2 de baja afinidad, el transporte residual de Leucina en la mutante gap1let1let2 tuvo el mismo KT que el de la cepa parental gap1LET1LET2. Resultados similares se obtuvieron para los únicos sistemas de transporte de isoleucina o valina. Lamutante gap1let1let2 exhibió una marcada disminución en el crecimiento sobre medio minimoconteniendo Leucina, isoleucina o valina como únicas fuentes de nitrógeno. Además, la asimilación demetionina, fenilalanina, serina, treonina y norleucina estuvo impedida severamente, mientras losaminoácidos básicos y ácidos sostuvieron un crecimiento normal. Esto indica que al menos una de laspermeasas de Leucina tiene una considerablemente amplia pero aún limitada especificidad. La reversióndel gen gap1 restauró el transporte de los aminoácidos de cadena ramificada. La cepa revertante fuesensible a TFL cuando creció en prolina, pero resistente cuando amonio fue la fuente de nitrógeno. La segregante (sensible a TFL) gap1let2 exhibió para cada uno de los aminoácidos de cadenaramificada, solamente un sistema de transporte de alta afinidad-baja capacidad. Esta cepa mostróparámetros cinéticos para el transporte de Leucina muy similares a aquellos caracterizados para elsistema S1 en la cepa gap1. Cada uno de los sistemas de transporte de alta afinidad de losaminoácidos de cadena ramificada es inhibido competitivamente por los otros dos aminoácidos decadena ramificada. Además, metionina, norleucina y TFL actúan como inhibidores competitivos deltransporte de Leucina por el sistema de alta afinidad. En la mutante gap1let2 la deficiencia en laactividad de S2 resulta en la perdida de la capacidad de crecer significativamente en medios de cultivoconteniendo treonina, serina y norleucina como únicas fuentes de nitrógeno y un crecimiento reducidosobre los aminoácidos de cadena ramificada individuales, metionina y fenilalanina. Por lo tanto, el gen LET1 codifica la permeasa de L-aminoácidos de cadena ramificada de alta afinidad-baja capacidad S1,y posiblemente transporte también metionina y -fenilalanina. La permeasa LET1 (St) es primariamenteresponsable de la acumulación intracelular de TFL a niveles tóxicos, porque este sistema no esdetectable en la mutante resistente a TFL gap1let1let2. En contraste, la segregante gap1/eN exhibiópara cada uno de los aminoácidos de cadena ramificada solamente un sistema de transporte de bajaafinidad- alta capacidad. Esta cepa mostró para el transporte de Leucina un valor de KT muy similar aaquel caracterizado para el sistema S2 en la cepa gap1 aunque con un valor de Jmax mas alto. Un únicosistema de transporte de baja afinidad -alta capacidad para isoleucina o valina mostró similarescaracterísticas. Esta cepa crece normalmente como la cepa gap1 sobre todas las fuentes de nitrógenoensayadas. Isoleucina, valina, metionina, alanina y norleucina son inhibidores competitivos deltransporte de Leucina por el sistema S2. Los valores de Ki están en el orden de los valores de KTdeterminados para el transporte de Leucina, isoleucina y valina. DL-TFL es un inhibidor competitivo delsistema S2 pero el valor Kies más grande que el valor de KTpara el transporte de Leucina. Por Io tanto.el sistema S2 de baja afinidad- alta capacidad tiene una relativamente amplia especificidad.transportando no sólo los aminoácidos de cadena ramificada sino también metionina, alanina, serina.treonina y norleucina. Estos resultados sugieren que el gen LET2 codifica un componente asociado a laóptima actividad del sistema S2. La regulación de la actividad de transporte por la fuente de nitrógeno presente en el medio de cultivoindica que la permeasa LET1 (S1) no está sujeta a la represión catabólica por nitrógeno ni a lainactivación catabólica por nitrógeno (NCI). En contraste, en la cepa gap1 la actividad de transporte de L-leucina por S2 es regulada negativamente por los iones amonio. Más aún, en esta condición, eltransporte de L-leucina por el sistema S2 en las cepas gap1 y gap1let1let2 exhibió parámetros Cineticossimilares. En la segregante gap1/en el comportamiento regulatorio fue diferente. Las activdades detransporte de los aminoácidos de cadena ramificada por S2 fueron más altas que aquellas obtenidas enlas células mutantes gap1 o gap1let1let2 crecidas en los medios de cultivo conteniendo L-prolina oiones amonio como únicas fuentes de nitrógeno. Estos resultados sugieren una tercera mutaciónademás de let1 y let2 que podría interferir con la incorporación de los aminoácidos de cadena ramificadao de una interacción entre los productos de los genes LET1 y LET2. Kinetic and genetic evidence show that the uptake of L-branched-chain amino acids into Saccharomyces cerevisiae is mediated by at least three functionally distinct systems: the general aminoacid permease GAP1 (inactive in the presence of ammonium ions), and two transport systems morespecific S1 and 82, previously described for L-leucine transport. Wild type cells grown in medium containing L-proline as nitrogen source, exhibit a single transportsystem for each of the L-branched-chain amino acids of high-affinity and very high-capacity A gap1mutant shows two transport systems for leucine wrth KTand Jma, values Similar to those previouslydescribed as S1 and 82, and a single low affinity-high capacity transport system for isoleucine or valine. A strain mutant defective in Systems S1 and S2 transporting L-leucine was isolated from the parentalstrain already deficient in the general amigo acid permease, GAP1. The mutant was selected as aspontaneous, trifluoroleucine-resistant (TFL) strain. This mutant was crossed with gap1 tester strain.and tetrad analysis indicated that full resistance to TFL was dependent upon the presence of at least twounlinked mutant genes, denominated let (leucine transport). The let1 mutation completely inactivates thehigh affinity-low capacity leucine transport system kinetically defined as S1. Although the let2 mutationcaused a marked decrease in the Jmax of the low affinity system S2, residual transport in the gap1let1let2mutant had the same KT as in the gap1LET1LET2 parental strain. Similar results were obtained for thesingle transport system of L-isoleucine or L-valine. The gap1let1let2 mutant exhibited a marked decreasein growth on minimal medium containing leucine, isoleucine or valine as a sole nitrogen source. Moreover, assimilation of methionine, phenylalanine, serine, threonine and norleucine, was severelyimpaired, whereas basic and acidic amino acids supported normal growth. This indicates that at leastone of leucine permeases has a fairly broad, but yet limited specificity. Reversion of the gap1 generestored branched-chain amino acids transport. The revertant strain was sensitive to TFL when grown onproline but resistant to TFL when ammonia was the nitrogen source. The gap1let2 (TFL-sensitive) segregant exhibited for each of the L-branched-chain amino acids onlyone transport system of high affinity-low capacity. This strain showed transport kinetic parameters for L-Leucine very similar to those characterized for system S1 in a gap1 strain. Each of the high-affinitytransport systems for the L-branched-chain amino acids is inhibited competitively by the other twobranched chain amino acids. ln addition, methionine, norleucine and trifluoroleucine act as competitiveinhibitors of the high affinity transport system of leucine. In mutant gap1let2 the deficiency in L-leucine S2 activity results, in the loss of its ability to grow significantly in culture media containing threonine, serine or norleucine as the sole nitrogen source and in a decreased growth on individual branched chain amino acids, methionine and phenylalanine. Therefore, the gene LET1 encodes for the high affinity-low capacity L-branched-chain amino acids permease S1 and very likely for methionine and phenylalanine as well. The LET1 permease (S1) is primarily responsible for the intracellular accumulation of TFL up to toxic levels, because this system is not detectable in the TFL-resistant mutant gap1let1let2. In contrast, the gap1let1 segregant exhibited only one system transport of low affinity-high capacity for each of the Lbranched-chain amino acids. This strain, showed a transport KT value for leucine very similar to that characterized for system S2 in a gap1 strain although with the higher Jmax value. A single low affinity-high capacity transport system for isoleucine or valine shown similar characteristics. This strain, alike gap1 strain grows normally on all nitrogen sources assayed. lsoleucine, valine, methionine, alanine and norleucine are competitive inhibitors of the Ieucrne transport system S2. The Ki values are of the same order as the KT values determined for leucine, isoleucine and valine transport. TFL is a competitive inhibitor of the S2 system but its Ki value is larger than the KT value for -Leucine transport. Therefore, the low affinity-high capacity system S2 has a relatively broad specificity, transporting not only branched chainaminoacids but also methionine, alanine, serine, threonine and norleucine. These results suggestthat LET2 encodes for a component which is associated to optimum activity of transport system S2. Regulation of transport activity by the nitrogen source indicates that S1 permease is not subject tonitrogen catabolite repression (NCR) nor to nitrogen catabolite inactivation (NCI). In gap1 strain theleucine transport S2 activity is negatively regulated by ammonium ions. Moreover, under this conditionleucine transport by S2 system in gap1 and gap1/et1/e12 strains, exhibited similar kinetic parameters. Inthe segregant gap1let1 the regulatory behaviour was different. The branched-chain amino acidstransport activities by S2 were higher that those obtained in gap1 or gap1let1/et2 mutant cells grown inculture media containing L-proline or ammonium ions as sole nitrogen source. These results suggest theexistance of a third mutation, besides let1 and let2 which could interfere with the L-branched chain aminoacids uptake or of an interaction between the products of the genes LET1 and LET2. Fil: Chianelli, Mónica Silvia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 1998 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3006_Chianelli

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