Síntesis de glucanos alfa 1,4 unidos a proteína en músculo cardíaco de rata

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El glucógeno es el polisacárido de reserva presente en tejidos animales,así como también en algunas plantas superiores, hongos y bacterias. Es unhomopolímero ramificado de moléculas de D-glucosa, unidas entre sí poruniones glucosídicas α 1,4, mientras que en los puntos de ramificación presenta union...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Blumenfeld, Marta Liliana
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 1986
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1956_Blumenfeld
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Este esquema de síntesis corresponde en realidad a un mecanismo de alargamiento de glucanos α 1,4 preexistentes. El hecho de que la glucógeno sintetasa requiera un "primer" o aceptorpara los residuos de glucosa que se van a transferir plantea, por lo tanto, el problema de cómo se lleva a cabo la síntesis "de novo" del glucógeno. Es decir, cómo se sintetiza una molécula de glucógeno cuando en la célula no existe aceptor para la glucógeno sintetasa. Se ha demostrado que fracciones microsomales de hígado de rata y de Escherichia coli carentes de glucógeno transfieren marca radioactiva a partir de nucleótido-(14C)glucosa a un compuestoinsoluble en ácido tricloroacético (TCA), que es sensible a ladigestión con enzimas amilolíticas o proteolíticas. En base a estos resultados y evidencias adicionales, Krisman ha postuladoque la síntesis "de novo" del glucógeno involucraría una etapa inicial deformación de una glucoproteína catalizada por una enzima distinta de laglucógeno sintetasa. Los glucanos así sintetizados, unidos covalentemente a la proteína, servirían a su vez como "primers" para la acción conjunta de la glucógeno sintetasa y la enzima ramificante. Se formarían entonces moléculas de glucógeno unidas a proteína que serían liberadas de la misma por acción de enzimas de tipo amilolítico, proporcionando así aceptores para la síntesisdel glucógeno no unido a proteína, según el esquema clásico. Este modelo ha sido apoyado por la demostración de la existencia "invivo" de glucógeno unido a proteína (desmoglucógeno) en sistemas tales como hígado y corazón de rata. En el caso particular del músculo cardíaco de rata, se ha descripto que alrededor del 50% del glucógeno extraíble por agua a 100°C, es insoluble en TCA, y que 25% del polisacárido sigue precipitando con ácido aún después de digestión con solución alcalina caliente. Por otra parte, el glucógeno insoluble en TCA puede ser solubilizado por proteólisis. Estos resultados, si bien no demuestran la existencia de una unión covalente entre polisacárido y proteína, sugieren una fuerte asociación entre ambos. Con el objeto de ampliar y generalizar las observaciones realizadas enhígado de rata y E. coli, y considerando que el músculo cardíaco de rataconstituía un sistema adecuado, se estudió la formación de glucanos α 1,4unidos a proteína y su probable papel como intermediarios en la síntesis "de novo" del glucógeno. Los resultados obtenidos se resumen a continuación. - Se puso a punto la preparación de fracciones microsomales de músculocardíaco de rata con muy bajo contenido de glucógeno. - Después de incubar estas preparaciones enzimáticas con UDP-(14C)Glc, seincorporó radioactividad a un aceptor endógeno presente en una fraccióninsoluble en TCA 10% (fracrión TCApp), y en menor grado a una fracciónsoluble en ácido e insoluble en alcohol (fracción TCAsol-EtOHpp). La actividad enzimática en ausencia de "primer" se denominó GS-2. La insolubilidad en ácido de la (14C)glucosa incorporada indicó que el producto mayoritario de la reacción GS-2 era un glucoconjugado, y que la aglicona era probablemente una proteína. La radiomarca insoluble en TCA fue precursora de la presente en la fracción TCAsol-EtOHpp. Esto requirió la incorporación previa de restos glucosilo del UDP-Glc. Las curvas de tiempo de la actividad GS-2 presentaron un período "lag" quevarió con la concentración de UDP-Glc y con la preparación. Este período de latencia correspondió a la formación de un mejor aceptor para la transferencia de restos glucosilo del UDP-Glc, ya que desapareció al preincubar las mezclas de reacción con nucleótido-azúcar no radioactivo. Las preparaciones enzimáticas presentaron también actividad de glucógenosintetasa (actividad GS-1), medida como la incorporación de glucosa del UDP-Glc al glucógeno exógeno presente en el precipitado etanólico de lamezcla de reacción digerida con KOH (fracción KOH-EtOHpp). El agregado de glucógeno durante el ensayo GS-2 inhibió la incorporación de (14C)glucosa a la fracción TCApp, pero aumentó la correspondiente a TCAsol-EtOHpp. En este caso, la reacción se llevó a cabo sin período "lag", al igual que lo que ocurrió con el ensayo GS-1. Por lo tanto, el aceptor endógeno era distinto, al menos en parte, que el glucógeno exógeno, el cual era un mejor sustrato para la transferencia de restos glucosilo. Se estudiaron algunas propiedades de la actividad GS-2 (curva de UDP-Glc,efecto de la preincubación, concentración de proteínas y temperatura), asícomo diversas propiedades comparativas de las actividades GS-1 y GS-2 (efecto del DTT, sales, nucleótidos de uridina y adenina, y otros activadores e inhibidores, PH, y especificidad del nucleótido-azúcar). Se concluyó que las actividades GS-1 y GS-2 eran catalizadas por la mismaenzima, la glucógeno sintetasa, y que las diferencias observadas en algunos casos se debían a la variación del cosustrato aceptor de la reacción:glucógeno exógeno para GS-1 y aglicona endógena para GS-2. Los productos radioactivos insolubles en TCA, sintetizados durante la reacción GS-2 fueron degradados por α- o β-amilasas, amiloglucosidasa o proteasa libre de amilasa. El grado de sensibilidad a la digestión con enzimas amilolíticas correspondió al de una estructura ramificada semejante a la del glucógeno nativo. La radioactividad insoluble en ácido se solubilizó por tratamiento ácidosuave (HCl 0,01 ó 0,1 N, 15 min, 100°C). La cinética de ambas hidrólisissugirió que la (14C)glucosa estaba unida a la aglicona por al menos dostipos de uniones distintas, cuyos t1/2 eran similares al de la unión ésterfosfato. La permetilación e hidrólisis ácida total de los compuestos liberados por HCl 0,1 N confirmaron que la porción sacarídica del glucoconjugado sintetizado durante la reacción GS-2 tenía la estructura ramificada delglucógeno nativo. Se purificó parcialmente la glucógeno sintetasa, separándose cromatográficamente dos especies enzimáticas: una, que presentaba las actividades GS-1 y GS-2 (fracción D1A), y otra que solo tenía actividad GS-1 (fracción D2A). La actividad GS-2 de D1A fue estimulada por Glc-6-P y, en menor grado, porotros ésteres fosfato. Estos compuestos activaron de forma semejante laactividad GS-1. La fracción D2A, que no presentaba actividad GS-2, tambiénfue activada por estos compuestos. La fracción D1A no fue capaz de sintetizar glucanos insolubles en ácido apartir de aceptores exógenos no unidos a proteína (maltosacáridos oglucógeno), indicando que los aceptores endógenos de la actividad GS-2 noeran de este tipo. Al igual que en el caso de las fracciones microsomales, los compuestos radioactivos insolubles en TCA sintetizados por D1A fueron sensibles a ladegradación amilolítica o proteolítica. Se desarrolló un método de detección "in situ" de actividad de glucógenosintetasa en geles de poliacrilamida en condiciones nativas. Este métodopermitió determinar que las actividades GS-1 y GS-2 eran catalizadas poruna misma proteína. Por otra parte, dado que se pudo detectar actividad enausencia de "primer" después de una corrida electroforética, se concluyóque la enzima y el aceptor endógeno de la reacción GS-2 estaban fuertemente asociados, ya que migraban juntos en electroforesis. Los productos de reacción de GS-2 sintetizados por D1A se analizaronmediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Se observó migración de (14C)glucosa tanto en condiciones nativas como desnaturalizantes. En este último caso se comprobó que la movilidad de las bandas radioactivas disminuía en función del tiempo de incubación. Por otra parte, la radioactividad desapareció después de incubar las mezclas con α-amilasa. Cuando se estudiaron muestras provenientes de un pulso con UDP-(14C)Glc y posterior "chase" con nucleótido-azúcar no radioactivo, se verificó que las especies radioactivas de mayor movilidad daban lugar, después del "chase" a las de menor migración. Por su parte, las bandas radiomarcadas más móviles se regeneraron por incubación de las mezclas de reacción con amiloglucosidasa. La preincubación de la fracción D1A con α-amilasa insoluble produjo unanotable disminución de la actividad GS-2 sin afectar mayormente la actividad GS-1 de la preparación. En consecuencia, se demostró que las preparaciones enzimáticas de músculocardíaco de rata estudiadas en el presente trabajo de tesis catalizaban lasíntesis "in vitro" de glucanos α 1,4 unidos a proteína. El aceptor proteico tenía, en este caso en particular, glucanos presintetizados "in vivo", los que eran alargados por la glucógeno sintetasa durante el ensayo GS-2, y en el caso de las preparaciones microsomales, eran ramific Consulte el resumen completo en el documento.
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Una vez sintetizada una cadena glucosídica α 1,4 de largo suficiente, la enzima ramificante produce un reordenamiento de la misma, formando un punto de ramificación α 1,6. Este esquema de síntesis corresponde en realidad a un mecanismo de alargamiento de glucanos α 1,4 preexistentes. El hecho de que la glucógeno sintetasa requiera un "primer" o aceptorpara los residuos de glucosa que se van a transferir plantea, por lo tanto, el problema de cómo se lleva a cabo la síntesis "de novo" del glucógeno. Es decir, cómo se sintetiza una molécula de glucógeno cuando en la célula no existe aceptor para la glucógeno sintetasa. Se ha demostrado que fracciones microsomales de hígado de rata y de Escherichia coli carentes de glucógeno transfieren marca radioactiva a partir de nucleótido-(14C)glucosa a un compuestoinsoluble en ácido tricloroacético (TCA), que es sensible a ladigestión con enzimas amilolíticas o proteolíticas. En base a estos resultados y evidencias adicionales, Krisman ha postuladoque la síntesis "de novo" del glucógeno involucraría una etapa inicial deformación de una glucoproteína catalizada por una enzima distinta de laglucógeno sintetasa. Los glucanos así sintetizados, unidos covalentemente a la proteína, servirían a su vez como "primers" para la acción conjunta de la glucógeno sintetasa y la enzima ramificante. Se formarían entonces moléculas de glucógeno unidas a proteína que serían liberadas de la misma por acción de enzimas de tipo amilolítico, proporcionando así aceptores para la síntesisdel glucógeno no unido a proteína, según el esquema clásico. Este modelo ha sido apoyado por la demostración de la existencia "invivo" de glucógeno unido a proteína (desmoglucógeno) en sistemas tales como hígado y corazón de rata. En el caso particular del músculo cardíaco de rata, se ha descripto que alrededor del 50% del glucógeno extraíble por agua a 100°C, es insoluble en TCA, y que 25% del polisacárido sigue precipitando con ácido aún después de digestión con solución alcalina caliente. Por otra parte, el glucógeno insoluble en TCA puede ser solubilizado por proteólisis. Estos resultados, si bien no demuestran la existencia de una unión covalente entre polisacárido y proteína, sugieren una fuerte asociación entre ambos. Con el objeto de ampliar y generalizar las observaciones realizadas enhígado de rata y E. coli, y considerando que el músculo cardíaco de rataconstituía un sistema adecuado, se estudió la formación de glucanos α 1,4unidos a proteína y su probable papel como intermediarios en la síntesis "de novo" del glucógeno. Los resultados obtenidos se resumen a continuación. - Se puso a punto la preparación de fracciones microsomales de músculocardíaco de rata con muy bajo contenido de glucógeno. - Después de incubar estas preparaciones enzimáticas con UDP-(14C)Glc, seincorporó radioactividad a un aceptor endógeno presente en una fraccióninsoluble en TCA 10% (fracrión TCApp), y en menor grado a una fracciónsoluble en ácido e insoluble en alcohol (fracción TCAsol-EtOHpp). La actividad enzimática en ausencia de "primer" se denominó GS-2. La insolubilidad en ácido de la (14C)glucosa incorporada indicó que el producto mayoritario de la reacción GS-2 era un glucoconjugado, y que la aglicona era probablemente una proteína. La radiomarca insoluble en TCA fue precursora de la presente en la fracción TCAsol-EtOHpp. Esto requirió la incorporación previa de restos glucosilo del UDP-Glc. Las curvas de tiempo de la actividad GS-2 presentaron un período "lag" quevarió con la concentración de UDP-Glc y con la preparación. Este período de latencia correspondió a la formación de un mejor aceptor para la transferencia de restos glucosilo del UDP-Glc, ya que desapareció al preincubar las mezclas de reacción con nucleótido-azúcar no radioactivo. Las preparaciones enzimáticas presentaron también actividad de glucógenosintetasa (actividad GS-1), medida como la incorporación de glucosa del UDP-Glc al glucógeno exógeno presente en el precipitado etanólico de lamezcla de reacción digerida con KOH (fracción KOH-EtOHpp). El agregado de glucógeno durante el ensayo GS-2 inhibió la incorporación de (14C)glucosa a la fracción TCApp, pero aumentó la correspondiente a TCAsol-EtOHpp. En este caso, la reacción se llevó a cabo sin período "lag", al igual que lo que ocurrió con el ensayo GS-1. Por lo tanto, el aceptor endógeno era distinto, al menos en parte, que el glucógeno exógeno, el cual era un mejor sustrato para la transferencia de restos glucosilo. Se estudiaron algunas propiedades de la actividad GS-2 (curva de UDP-Glc,efecto de la preincubación, concentración de proteínas y temperatura), asícomo diversas propiedades comparativas de las actividades GS-1 y GS-2 (efecto del DTT, sales, nucleótidos de uridina y adenina, y otros activadores e inhibidores, PH, y especificidad del nucleótido-azúcar). Se concluyó que las actividades GS-1 y GS-2 eran catalizadas por la mismaenzima, la glucógeno sintetasa, y que las diferencias observadas en algunos casos se debían a la variación del cosustrato aceptor de la reacción:glucógeno exógeno para GS-1 y aglicona endógena para GS-2. Los productos radioactivos insolubles en TCA, sintetizados durante la reacción GS-2 fueron degradados por α- o β-amilasas, amiloglucosidasa o proteasa libre de amilasa. El grado de sensibilidad a la digestión con enzimas amilolíticas correspondió al de una estructura ramificada semejante a la del glucógeno nativo. La radioactividad insoluble en ácido se solubilizó por tratamiento ácidosuave (HCl 0,01 ó 0,1 N, 15 min, 100°C). La cinética de ambas hidrólisissugirió que la (14C)glucosa estaba unida a la aglicona por al menos dostipos de uniones distintas, cuyos t1/2 eran similares al de la unión ésterfosfato. La permetilación e hidrólisis ácida total de los compuestos liberados por HCl 0,1 N confirmaron que la porción sacarídica del glucoconjugado sintetizado durante la reacción GS-2 tenía la estructura ramificada delglucógeno nativo. Se purificó parcialmente la glucógeno sintetasa, separándose cromatográficamente dos especies enzimáticas: una, que presentaba las actividades GS-1 y GS-2 (fracción D1A), y otra que solo tenía actividad GS-1 (fracción D2A). La actividad GS-2 de D1A fue estimulada por Glc-6-P y, en menor grado, porotros ésteres fosfato. Estos compuestos activaron de forma semejante laactividad GS-1. La fracción D2A, que no presentaba actividad GS-2, tambiénfue activada por estos compuestos. La fracción D1A no fue capaz de sintetizar glucanos insolubles en ácido apartir de aceptores exógenos no unidos a proteína (maltosacáridos oglucógeno), indicando que los aceptores endógenos de la actividad GS-2 noeran de este tipo. Al igual que en el caso de las fracciones microsomales, los compuestos radioactivos insolubles en TCA sintetizados por D1A fueron sensibles a ladegradación amilolítica o proteolítica. Se desarrolló un método de detección "in situ" de actividad de glucógenosintetasa en geles de poliacrilamida en condiciones nativas. Este métodopermitió determinar que las actividades GS-1 y GS-2 eran catalizadas poruna misma proteína. Por otra parte, dado que se pudo detectar actividad enausencia de "primer" después de una corrida electroforética, se concluyóque la enzima y el aceptor endógeno de la reacción GS-2 estaban fuertemente asociados, ya que migraban juntos en electroforesis. Los productos de reacción de GS-2 sintetizados por D1A se analizaronmediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Se observó migración de (14C)glucosa tanto en condiciones nativas como desnaturalizantes. En este último caso se comprobó que la movilidad de las bandas radioactivas disminuía en función del tiempo de incubación. Por otra parte, la radioactividad desapareció después de incubar las mezclas con α-amilasa. Cuando se estudiaron muestras provenientes de un pulso con UDP-(14C)Glc y posterior "chase" con nucleótido-azúcar no radioactivo, se verificó que las especies radioactivas de mayor movilidad daban lugar, después del "chase" a las de menor migración. Por su parte, las bandas radiomarcadas más móviles se regeneraron por incubación de las mezclas de reacción con amiloglucosidasa. La preincubación de la fracción D1A con α-amilasa insoluble produjo unanotable disminución de la actividad GS-2 sin afectar mayormente la actividad GS-1 de la preparación. En consecuencia, se demostró que las preparaciones enzimáticas de músculocardíaco de rata estudiadas en el presente trabajo de tesis catalizaban lasíntesis "in vitro" de glucanos α 1,4 unidos a proteína. El aceptor proteico tenía, en este caso en particular, glucanos presintetizados "in vivo", los que eran alargados por la glucógeno sintetasa durante el ensayo GS-2, y en el caso de las preparaciones microsomales, eran ramific Consulte el resumen completo en el documento. Fil: Blumenfeld, Marta Liliana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 1986 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1956_Blumenfeld

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