Caracterización de dos isoformas de CDPKs de Solanum tuberosum (papa) : análisis de sus expresiones en respuesta a estrés hídrico

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El calcio es un segundo mensajero ubicuo en plantas que participa en la señalización de estímulos bióticos y abióticos. Las oscilaciones del catión son decodificadas por distintos sensores, entre ellos se destacan las quinasas de proteínas dependientes de calcio (CDPKs). Estas enzimas presentan un d...

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Autor principal: Sciorra, Marcelo Daniel
Otros Autores: Ulloa, Rita María
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2020
Materias:
QUINASAS DE PROTEINAS DEPENDIENTES DE CALCIO (CDPKs)
FOSFORILACION DEPENDIENTE DE Ca2+
VIAS DE SEÑALIZACION
SOLANUM TUBEROSUM
CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASES
CALCIUM-DEPENDENT PHOSPHOTYLATION
SIGNALING PATHWAYS
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7098_Sciorra
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Estas enzimas presentan un dominio catalítico de quinasa de serina/treonina (KD) fusionado a través de un dominio autoinhibitorio (AD) a un dominio regulador similar a calmodulina (CLD) con cuatro sitios EF-hands de unión al calcio. La familia CDPK en papa (Solanum tuberosum) está compuesta por 26 miembros divididos en cuatro grupos; cinco CDPKS pertenecen al grupo III y tres de ellas, StCDPK22/23/24, presentan sólo tres sitios EF-hands en su dominio regulatorio faltando el sitio más cercano al AD (Fantino et al. 2017). Una nueva búsqueda permitió encontrar un nuevo miembro de este grupo, StCDPK27, que también presenta tres sitios EF-hand, pero en este caso carece del segundo sitio. El análisis filogenético de los miembros del grupo III reveló que las isoformas que carecen del primer sitio EF-hand forman un clado aparte. Se ha reportado que CDPKs con sólo 3 sitios presentan menor sensibilidad por el calcio (Boudsocq et al. 2012). Con el fin de analizar su dependencia por el catión, se amplificaron las secuencias codificantes de StCDPK22 y StCDPK24, y se generaron y purificaron las proteínas recombinantes, StCDPK22:6xHis y StCDPK24:6xHis (524 y 532 aa respectivamente). Ambas isoformas comparten 78% de identidad nucleotídica y 80% a nivel aminoacídico. A pesar de la gran identidad de secuencia de su KD presentan diferencias en su actividad quinasa y en la preferencia por el complejo ATP-Me2+. Se observa que StCDPK24 presenta mucha mayor actividad en todas las condiciones ensayadas y tiene una clara preferencia por el complejo ATP-Mg2+, presenta una dependencia parcial por Ca2+ y antagonistas de calmodulina disminuyen su actividad. Se determinó que Syntide-2 fue el mejor sustrato aceptor y con éste se determinaron los parámetros cinéticos (Vmáx y KM). Por su parte, StCDPK22 tiene muy baja actividad (casi nula), no se observa una clara dependencia por calcio y su actividad mejora cuando se utiliza ATP-Mn2+ como sustrato dador. Ambas isoformas presentan un patrón similar de autofosforilación en ausencia de calcio (Y39 o S33 del NTV, S321 o S323 y T325 o T327 del AD y S521 o S523 del CTV para StCDPK22 o StCDPK24 respectivamente). Además, StCDPK22 se fosforiló en dos residuos del KD (S83 y S297) en ausencia de calcio; mientras que StCDPK24 se autofosforiló en dos residuos del CLD (S438 y S445) sólo en presencia de calcio sugiriendo que esta isoforma es regulada por el catión. Es interesante que AtCPK8 de Arabidopsis también se autofosforila en los mismos residuos del AD y CTV sugiriendo que puede ser una forma de regulación de las CDPKS del clado. Se realizó un modelado in silico de la estructura secundaria y terciaria de ambas enzimas. Los datos de RT-qPCR indican que StCDPK22 presenta una expresión más restringida a flor y estadios tempranos de tuberización mientras que la expresión de StCDPK24 es ubicua, aunque fue mayor en brotes jóvenes, tallo, flor, hoja y estadios de tuberización. El análisis in silico de sus promotores permitió identificar varios motivos de respuesta a ABA y a estrés abiótico, por lo que su expresión se analizó en respuesta a la salinidad utilizando plantas in vitro y de invernadero. StCDPK24 se induce tempranamente (6 h) en respuesta a la sal en plantas in vitro para luego decaer. Lo mismo ocurrió en tallo de plantas de invernadero tratadas con sal (8 h). Nuestros resultados indican que ambas CDPKs difieren tanto en su actividad como en sus perfiles de expresión y la expresión espacio-temporal de StCDPK24 en respuesta al estrés salino sugiere que podría participar en esta cascada de señalización [fórmula aproximada, revisar la misma en el original]. Plants are exposed to a variety of external and endogenous stimuli that affect and modulate their development. Calcium is a ubiquitous messenger involved in signaling biotic and abiotic stimuli, whose oscillations are decoded by different sensors. Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) are sensors/transducers that participate in various signaling pathways and mediate responses to different stimuli. These enzymes have a serine/threonine kinase (KD) catalytic domain fused through an auto-inhibitory domain (AD) to a calmodulin-like regulatory domain (CLD) with four EF-hands calcium binding sites. The CDPK potato family (Solanum tuberosum) is composed of 26 members divided into four groups; group III has five members and three of them StCDPK22/23/24, have only three EF-hands sites in their CLD (EF-hand1 is lost) (Fantino et al. 2017). A new search allowed us to identify another member of this group, StCDPK27, which also presents three EF-hands but in this case, EF-hand2 is missing. A phylogenetic analysis indicated that StCDPK22/23/24 are clustered in a different clade with other CDPKs from different species that lack the first EF-hand. CDPKs with only three EF-hands were reported to display less calcium sensitivity (Boudsocq et al. 2012). In order to analyze their calcium dependence, the coding sequences of StCDPK22 and StCDPK24 genes were amplified, and recombinant proteins, StCDPK22:6xHis and StCDPK24:6xHis (524 and 532 aa respectively) were generated and purified. Both isoforms share 78% of nucleotide identity and 80% at the amino acid level. Despite the great sequence identity, they show differences in their kinase activity and in their preference for ATP-Me²+ complex. StCDPK24 has much greater activity in all the conditions tested, it is partially dependent on calcium, calmodulin antagonists decrease its activity indicating that the CLD is required, and it prefers ATP-Mg2+; while StCDPK22 has scarce or null activity, does not depend on calcium for activity, and prefers ATP-Mn2+. Their kinetic parameters were determined. Both kinases present a similar autophosphorylation profile in the absence of calcium (Y39 or S33 in the NTV, S321 or S323 and T325 or T327 in the AD and S521 or S523 in the CTV for StCDPK22 or StCDPK24 respectively). StCDPK22 was also autophosphorylated in two residues of the KD (S83 and S297) in the absence of calcium, while StCDPK24 was autophosphorylated in a calcium dependent manner in two residues in the CLD (S438 and S445). Interestingly both kinases share with AtCPK8 the same autophosphorylation pattern in the KD and CTV, suggesting that it could be a way of regulating the activity of these CDPKs. In silico modeling of the secondary and tertiary structure of both enzymes was performed. Analysis by RT-qPCR revealed that StCDPK22 expression is restricted to flower and early tuberization stages while StCDPK24 is more ubiquitous and its expression is higher in stems, leaves, shoots, flowers and tuberization stages. The in silico analysis of its promoters allowed to identify several ABA and abiotic stress responsive elements, so their expression was analyzed in response to salinity using in vitro and greenhouse plants. StCDPK24 expression was induced at 6 h and the declined in in vitro plants and a significant increase was observed at 8 h in stems of salt-treated greenhouse plants. On the contrary, StCDPK22 expression was not affected by salt. Our results indicate that both kinases display different activity and expression profiles, and the spatio-temporal expression of StCDPK24 in response to salt suggests that it could play a role in this specific response [fórmula aproximada, revisar la misma en el original]. Fil: Sciorra, Marcelo Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2020-07-01 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7098_Sciorra

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