Análisis estructural y bioquímico de la proteína de membrana externa GumB de Xanthomonas campestris, y su participación en la síntesis del exopolisacárido xantano

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Muchas bacterias producen polisacáridos extracelulares que pueden asociarse a lasuperficie celular o ser secretados al medio extracelular. Numerosos polisacáridosbacterianos se encuentran asociados al desarrollo de patogenicidad, convirtiéndose enun importante factor de virulencia. Por otro lado, ex...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Jacobs, Melisa
Otros Autores: Ielpi, Luis
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2014
Materias:
XANTHOMONAS CAMPESTRIS
TRANSPORTE
GUMB
XANTANO
COMPLEJOS DE MEMBRANA
TRANSPORT
XANTHAN
MEMBRANE COMPLEXES
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5591_Jacobs
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Muchas bacterias producen polisacáridos extracelulares que pueden asociarse a lasuperficie celular o ser secretados al medio extracelular. Numerosos polisacáridosbacterianos se encuentran asociados al desarrollo de patogenicidad, convirtiéndose enun importante factor de virulencia. Por otro lado, existe un gran interés industrial sobremuchos polisacáridos bacterianos debido a sus amplias aplicaciones. En general, se ha descripto en detalle los primeros pasos de la síntesis depolisacáridos, pero aún no se han esclarecido los mecanismos involucrados en lapolimerización y transporte de los mismos hacia la superficie bacteriana o al medioextracelular. Se ha postulado que estos procesos serían llevados a cabo gracias a laformación de complejos proteicos que podrían atravesar la membrana plasmática, deforma similar a lo observado para los sistemas de secreción de proteínas. En esta tesis se presenta el estudio estructural y bioquímico de la proteína demembrana externa GumB, la cual se encontraría asociada a la síntesis/secreción delpolisacárido xantano en Xanthomonas campestris. Fue posible sobreexpresar ypurificar cantidades suficientes para ensayos estructurales de esta proteína demembrana, al expresarla en el citoplasma. Se obtuvieron cristales de la proteína nativay de su derivado de selenio-metionina, a partir de los cuales fue posible resolver laestructura a 2,54 Å. Se encontró que en el cristal GumB forma un tetrámero, estacaracterística también se ha observado en solución mediante ensayos de dispersiónde luz estática y entrecruzamiento químico. Por otro lado, ensayos de dispersión deneutrones a bajos ángulos mostraron que la forma de GumB en solución es similar a laobservada en el cristal. El tetrámero de GumB mostró una gran cavidad con cargaspositivas que podrían estar involucradas en la interacción con el xantano, el cualposee cargas negativas debido a sus residuos de ácido glucurónico y grupos cetalpiruvato. Asimismo, se presenta evidencia que sugiere la participación de GumB en un complejoproteico. Mediante ensayos de entrecruzamiento químico in vivo se observó que GumB forma complejos de alto peso molecular. Electroforesis azul nativa permitióidentificar potenciales interacciones entre GumB y otras proteínas de X. campestris.
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En general, se ha descripto en detalle los primeros pasos de la síntesis depolisacáridos, pero aún no se han esclarecido los mecanismos involucrados en lapolimerización y transporte de los mismos hacia la superficie bacteriana o al medioextracelular. Se ha postulado que estos procesos serían llevados a cabo gracias a laformación de complejos proteicos que podrían atravesar la membrana plasmática, deforma similar a lo observado para los sistemas de secreción de proteínas. En esta tesis se presenta el estudio estructural y bioquímico de la proteína demembrana externa GumB, la cual se encontraría asociada a la síntesis/secreción delpolisacárido xantano en Xanthomonas campestris. Fue posible sobreexpresar ypurificar cantidades suficientes para ensayos estructurales de esta proteína demembrana, al expresarla en el citoplasma. Se obtuvieron cristales de la proteína nativay de su derivado de selenio-metionina, a partir de los cuales fue posible resolver laestructura a 2,54 Å. Se encontró que en el cristal GumB forma un tetrámero, estacaracterística también se ha observado en solución mediante ensayos de dispersiónde luz estática y entrecruzamiento químico. Por otro lado, ensayos de dispersión deneutrones a bajos ángulos mostraron que la forma de GumB en solución es similar a laobservada en el cristal. El tetrámero de GumB mostró una gran cavidad con cargaspositivas que podrían estar involucradas en la interacción con el xantano, el cualposee cargas negativas debido a sus residuos de ácido glucurónico y grupos cetalpiruvato. Asimismo, se presenta evidencia que sugiere la participación de GumB en un complejoproteico. Mediante ensayos de entrecruzamiento químico in vivo se observó que GumB forma complejos de alto peso molecular. Electroforesis azul nativa permitióidentificar potenciales interacciones entre GumB y otras proteínas de X. campestris. Many bacteria produce extracellular polysaccharides, which can be associated with thecell surface or secreted to the extracellular medium. Several bacterial polysaccharidesare associated with pathogenesis development, making them an important virulencefactor. On the other hand, there is an important industrial interest in many bacterialpolysaccharides because of their broad applications. The steps involved in polysaccharide synthesis are well described, but less is knownabout polysaccharide transport to the extracellular medium. It is believed that secretionis achieved due to a protein transenvelope complex, similar to those observed forprotein secretion systems. In this thesis, the outer membrane protein GumB was studied structurally andbiochemically. It has been previously shown that GumB is involved in thesynthesis/secretion of xanthan gum in Xanthomonas campestris. Proteinoverexpression and purification, in quantities enough to set up structural assays, wereachieved when this protein was expressed in the cytoplasm. Crystals of native proteinand its selenium-methionine derivative were obtained, allowing the determination of GumB crystal structure to 2.54 Å. In the crystal, GumB is a tetramer, a feature alsoobserved in solution by static light scattering and chemical crosslinking assays. Besides, small angle neutron scattering assays showed that GumB envelope insolution was similar to that observed in the crystal. GumB tetramer exhibited a cavitywith positive charges that could be involved in the interaction with xanthan, which is anegatively charged polysaccharide due to its glucuronic acid residues and ketalpyruvategroups. In addition, evidence suggesting that GumB is part of a protein complex is presented. By in vivo chemical crosslinking, it was observed that GumB forms high molecularcomplexes. Blue native electrophoresis allowed the identification of potentialinteractions between GumB and other proteins from X. campestris. Fil: Jacobs, Melisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2014-02-26 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5591_Jacobs

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