Estudio de las etapas tempranas del ciclo de replicación del Virus Junín

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El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada...

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Autor principal: Martínez, María Guadalupe
Otros Autores: Candurra, Nélida A.
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2010
Materias:
VIRUS JUNIN
ENDOCITOSIS
CLATRINA
CITOESQUELETO
LECTINAS
JUNIN VIRUS
ENDOCYTOSIS
CLATHRIN
CYTOSKELETON
LECTINS
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4658_Martinez
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro del citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia de codificación ambisentido. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside es denominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP). Estos conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en los eventos tempranos del ciclo de replicación viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación del JUNV. En primer lugar se analizó la vía de entrada utilizada por el JUNV para ser endocitado en las células, así como también se estudiaron las proteínas celulares esenciales para este proceso. Con este fin se utilizaron plásmidos que expresan proteínas dominantes negativas, encontrándose que es esencial la Eps-15 y dinamina en el proceso de endocitosis, mientras que las proteínas Rab5 y Rab7 juegan un rol esencial en el paso posterior a la internalización y previo a la fusión. Luego se estudio la interacción del virus con las principales redes del citoesqueleto: los microfilamentos y los microtúbulos. Se utilizaron compuestos capaces de despolimerizar o estabilizar específicamente cada una de estas redes. La internalización del virus disminuyó de manera dosisdependiente en presencia de compuestos que alteraban la integridad de los microfilamentos o estabilizaban los microtúbulos. El tropismo de los virus está regulado por la interacción entre factores celulares y virales durante la transmisión, diseminación y replicación en el huésped. La unión del virus a receptores de superficie específicos determina la susceptibilidad de las células a ser infectadas. La entrada y diseminación de diferentes familias virales puede ser mediada por lectinas de tipo C, como DC-sign o L-sign. Por este motivo se estudió si estas actúan en la infección con el JUNV. Para esto se utilizaron células relativamente no permisivas a la infección por JUNV como las células CHO, las cuales al expresar transientemente las lectinas DC-sign o L-sign fueron infectadas por el JUNV de forma altamente eficiente. Fue demostrado que las células 3T3, que en su forma salvaje no permiten la infección del JUNV, se vuelven permisivas al mismo al expresar de forma estable estas lectinas, y esta interacción es específica lo cual fue demostrado al bloquear la infección con anticuerpos específicos contra las lectinas o el compuesto mannan. Actualmente no hay tratamiento para las fiebres hemorrágicas, por lo que existe una necesidad crítica de desarrollar terapias efectivas para tratar los brotes anuales y contrarrestar su potencial uso como armas biológicas. Todos los virus causantes de fiebres hemorrágicas infectan preferencialmente monocitos, macrófagos y células dendríticas durante las etapas tempranas de la enfermedad. Es por este motivo que estas células representan un blanco potencial en el tratamiento de las fiebres hemorrágicas.
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A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP). Estos conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en los eventos tempranos del ciclo de replicación viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación del JUNV. En primer lugar se analizó la vía de entrada utilizada por el JUNV para ser endocitado en las células, así como también se estudiaron las proteínas celulares esenciales para este proceso. Con este fin se utilizaron plásmidos que expresan proteínas dominantes negativas, encontrándose que es esencial la Eps-15 y dinamina en el proceso de endocitosis, mientras que las proteínas Rab5 y Rab7 juegan un rol esencial en el paso posterior a la internalización y previo a la fusión. Luego se estudio la interacción del virus con las principales redes del citoesqueleto: los microfilamentos y los microtúbulos. Se utilizaron compuestos capaces de despolimerizar o estabilizar específicamente cada una de estas redes. La internalización del virus disminuyó de manera dosisdependiente en presencia de compuestos que alteraban la integridad de los microfilamentos o estabilizaban los microtúbulos. El tropismo de los virus está regulado por la interacción entre factores celulares y virales durante la transmisión, diseminación y replicación en el huésped. La unión del virus a receptores de superficie específicos determina la susceptibilidad de las células a ser infectadas. La entrada y diseminación de diferentes familias virales puede ser mediada por lectinas de tipo C, como DC-sign o L-sign. Por este motivo se estudió si estas actúan en la infección con el JUNV. Para esto se utilizaron células relativamente no permisivas a la infección por JUNV como las células CHO, las cuales al expresar transientemente las lectinas DC-sign o L-sign fueron infectadas por el JUNV de forma altamente eficiente. Fue demostrado que las células 3T3, que en su forma salvaje no permiten la infección del JUNV, se vuelven permisivas al mismo al expresar de forma estable estas lectinas, y esta interacción es específica lo cual fue demostrado al bloquear la infección con anticuerpos específicos contra las lectinas o el compuesto mannan. Actualmente no hay tratamiento para las fiebres hemorrágicas, por lo que existe una necesidad crítica de desarrollar terapias efectivas para tratar los brotes anuales y contrarrestar su potencial uso como armas biológicas. Todos los virus causantes de fiebres hemorrágicas infectan preferencialmente monocitos, macrófagos y células dendríticas durante las etapas tempranas de la enfermedad. Es por este motivo que estas células representan un blanco potencial en el tratamiento de las fiebres hemorrágicas. Junín virus (JUNV), the etiological agent of argentine hemorrhagic fever, is a member of the Arenaviridae family. The viral cycle multiplication of this RNA virus has been characterized in different aspects. The entrance in the target cells is performed by receptor-mediated endocytosis following pH dependant fusion step. Once the nucleocapsids are within the cytoplasm the ambisense strategy allows expression of five structural proteins. The major nucleocapsid associated protein is named NP. As a result of the glycoprotein precursor synthesis and after its maturation, two glycoproteins and a signal peptide are obtained. These components, named GP1, GP2 and SP, form the claviform structures found in the viral envelope. At this moment, the detailed mechanisms and cellular structures involved in the early steps of the virus replication cycle are not known although. In this work the interaction between virus and host cells was studied, characterizing the role of cellular proteins in early events of virus replication cycle. It was first evaluated the way of entry used by JUNV to entry host cells and the proteins involved in this process. With this end, plasmids that express dominant negative mutants were used, demonstrating that EPS-15 and dynamin were key proteins in this step, while Rab5 and Rab7 were essential in a step after entry prior to fusion. Then the interaction between JUNV and the main components of the cytoskeleton was evaluated. Compounds that specifically disrupt or stabilized microfilaments or microtubules were used. Virus entry was extremely reduced in a dose dependent way in the presence of compounds that depolimerized microfilaments or stabilized microtubules. Target cell tropism of enveloped viruses is regulated by interactions between viral and cellular factors during transmission, dissemination, and replication within the host. Binding of viral envelope glycoproteins to specific cellsurface receptors determines susceptibility to viral entry. The entry and dissemination of viruses in several families can be mediated by C-type lectins such as DC-sign and L-sign. Results from transduction with JUNV pseudovirus show that infection of relatively non-permissive CHO cells was markedly enhanced when we over expressed DC-sign or L-sign. Experiments using non-permissive mouse 3T3 cells showed that they become permissive to JUNV pseudovirus transduction when they stable express DC-sign, or its homologue L-sign, and that transduction of 3T3 stable expressing DC-sign or L-sign is blocked by anti–DC-sign and/or L-sign antibodies and mannan. Therefore hDC- and hL-sign can act as a novel attachment factors that mediate entry of JUNV. To the date there is no treatment for hemorrhagic fevers, so there is an important requirement to develop specific therapies against annual outbreaks and reduce its potential use as a bioterrorism agent. All hemorrhagic fever viruses infect preferentially monocytes, macrophages and dendritic cells during early stages of the disease. For this reason these cells represent a potential target in the treatment of hemorrhagic fevers. Fil: Martínez, María Guadalupe. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2010 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4658_Martinez

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