Mecanismos de proliferación dependientes del estado redox celular : rol de AKT y otras kinasas involucradas en la progresión del ciclo celular

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En las últimas décadas se demostró que la producción transitoria de peróxido de hidrógeno (H2O2) constituye un evento muy importante de señalización disparado a través de la activación de receptores de superficie o determinado por el estado metabólico mitocondrial, y que modula el grado de fosforila...

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Autor principal: Antico Arciuch, Valeria Gabriela
Otros Autores: Poderoso, Juan José
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2009
Materias:
H2O2
AKT1
ERK1/2
PROLIFERACION
APOPTOSIS
TRX
PROLIFERATION
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4562_AnticoArciuch
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Las mitocondrias normales poseen la mayor concentración celular de ATP y H2O2 en el estado estacionario y contribuyen naturalmente al grado de fosforilación y oxidación de proteínas, dos modificaciones post-traduccionales centrales en la activación de las kinasas. Sobre estas bases, formulamos la hipótesis que el estado redox produce efectos celulares diferenciales en consonancia con la activación de Akt1 y ERK1/2 en la mitocondria, y que en este compartimiento, el H2O2 determina cambios conformacionales que favorecen la fosforilación y posterior translocación nuclear de las mismas. Los estudios realizados en esta Tesis confirmaron que: 1) en la línea celular NIH/3T3, el H2O2 efectivamente modula la progresión del ciclo celular a través de la oxidación y fosforilación selectiva de Akt1 en mitocondrias; 2) en la línea tumoral LP07, el H2O2 asimismo promueve la oxidación selectiva de ERK1/2 o p38-JNK1/2 y posterior translocación al núcleo con efectos ulteriores en la proliferación celular; y 3) el sistema de tiorredoxinas (Trx) modula el destino celular regulando el nivel de oxidantes en las líneas celulares y provocando una activación selectiva en el eje central de Akt1 en el modelo tumoral analizado in vivo. En la línea NIH/3T3, la modulación por H2O2 involucró la entrada de P-Akt1 Ser473 a las mitocondrias, donde fue fosforilada en Thr308 por PDK1. A concentración celular limitada de H2O2, la fosforilación de Akt1 en Thr308 en mitocondrias fue significativa, determinó su pasaje al núcleo y disparó mecanismos genómicos que favorecieron la proliferación celular. En cambio, a elevadas concentraciones de H2O2, la asociación Akt1-PDK1 fue interrumpida y P-Akt1 Ser473 fue retenida en la mitocondria en detrimento de su translocación nuclear. La actividad disminuida de Akt1 favoreció la liberación de citocromo c al citosol conduciendo a la apoptosis. Los efectos diferenciales en la interacción Akt1-PDK1 dependieron de la oxidación selectiva de la Cys310 de Akt1 a ácido sulfénico y sulfónico. Las respuestas celulares observadas en la línea tumoral LP07 involucraron la activación selectiva de ERK1/2 y la interacción eficiente con MEK1/2 determinada por la oxidación de cisteínas conservadas pertenecientes a dominios redox sensibles. Estas modificaciones post-traduccionales que tuvieron lugar en la mitocondria determinaron el pasaje de la kinasa al núcleo. Considerando que las mitocondrias tumorales son disfuncionales, su incapacidad para incrementar la producción de H2O2 podría interrumpir la oxidación sincronizada de ERK1/2 y la regulación del ciclo celular causando la persistencia del fenotipo proliferante. En el mismo modelo tumoral analizado in vivo, el silenciamiento de Trx1 y 2 fue capaz de revertir el efecto de las condiciones redox proliferativas por una activación diferencial de Akt1. Los resultados obtenidos indicaron que al revertir la baja condición redox proliferante, P-Akt1 Ser473 aumentó en la mitocondria en detrimento de la translocación al núcleo, mientras que en los tumores que exhibieron bajo H2O2, P-Akt1 Ser473 se encontró predominantemente en el núcleo, sugiriendo una marcada modulación en la activación de la kinasa y su posterior translocación al núcleo. En esta Tesis, se demuestra el rol central del H2O2 en la activación y tráfico mitocondrial de Akt1 y ERK1/2 en la progresión del ciclo celular. Se concluye que la localización subcelular de estas kinasas en mitocondrias aporta un nuevo modelo para explicar la regulación de la activación por la oxidación de cisteínas específicas y la fosforilación en los residuos correspondientes. De esta forma, el ciclo intramitocondrial de Akt1 y ERK1/2 constituye un eje central para la modulación redox del destino celular en células normales o tumorales. Over the last decades, it has been demonstrated that the transitory production of hydrogen peroxide (H2O2) constitutes a very important event in signaling that can be triggered by activation of surface receptors or determined by mitochondrial metabolic state, and that modulates the phosphorylation level of certain proteins. In this context, recent studies have confirmed the presence of kinases in the mitochondria that we interpreted as a modulatory mechanism in the cellular availability of the kinases. Normal mitochondria have the major cellular ATP and H2O2 steady state concentrations and naturally contribute to the phosphorylation level and protein oxidation, two main postranslational modifications in the activation of kinases. On these bases, we postulated the hypothesis that redox state produces differential cellular effects in accord to Akt1 and ERK1/2 activation in mitochondria, and that in this compartment, H2O2 determines conformational changes that favor their phosphorylation and subsequent nuclear translocation. The studies performed in this Thesis confirmed that: 1) in NIH/3T3 cell line, H2O2 effectively modulates cell cycle progression through the oxidation and selective phosphorylation of Akt1 in mitochondria; 2) in the tumoral cell line LP07, H2O2 promotes as well the selective oxidation of ERK1/2 or p38-JNK1/2 and further translocation to nucleus with later effects in cell proliferation; and 3) the thiorredoxin system (Trx) modulates cell fate regulating the oxidant level and inducing a selective activation in the central axis of Akt1 in the tumoral model analyzed in vivo. In NIH/3T3 cell line, the modulation by H2O2 involved the entrance of P-Akt1 Ser473 to mitochondria, where it was phosphorylated in Thr308 by PDK1. At H2O2 cellular limiting concentrations, the phosphorylation of Akt1 in Thr308 in mitochondria was pronounced, determined its passage to nucleus and triggered genomic mechanisms that favoured cell proliferation. Oppositely, at higher H2O2 concentrations, Akt1-PDK1 association was disrupted and P-Akt1 Ser473 was retained in mitochondria in detriment of its nuclear translocation. Akt1 low activity favoured the release of cytochrome c to cytosol triggering apoptosis. The differential effects in Akt1-PDK1 interaction depended on the selective oxidation of Cys310 in Akt1 to sulfenic and sulfonic acid. The cellular responses observed in LP07 cell line engaged the selective activation of ERK1/2 and the efficient interaction with MEK1/2 determined by the oxidation of conserved cysteines belonging to redox sensitive domains. These postranslational modifications that took place in mitochondria determined the passage to nucleus. Considering that tumoral mitochondria are dysfunctional, the incapacity to increase H2O2 concentration could disrupt the synchronized oxidation of ERK1/2 and the regulation of cell cycle causing the persistence of the proliferative phenotype. In the same tumoral model analyzed in vivo, Trx1 and 2 silencing was able to revert the effect of redox proliferative conditions by a differential activation of Akt1. The obtained results indicated that in these conditions P-Akt1 Ser473 increased in mitochondria instead of translocating to nucleus, while in tumors with low H2O2 condition, P-Akt1 Ser473 was found predominantly in nucleus, suggesting a pronounced modulation in the activation and translocation of the kinase. In this Thesis, we demonstrated the key role of H2O2 in the activation and mitochondrial traffic of Akt1 and ERK1/2 in cell cycle progression. We conclude that the subcelullar localization of these kinases in mitochondria provides a new model to explain the regulation of the activation by oxidation of specific cysteines and the phosphorylation in the corresponding residues. In this sense, the intramitochondrial cycle of Akt1 and ERK1/2 constitutes a central axis for the redox modulation of cell fate in normal and tumoral cells. Fil: Antico Arciuch, Valeria Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2009 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4562_AnticoArciuch

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