Respuesta al daño al ADN : un ejemplo de acoplamiento entre transcripción y splicing alternativo

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El splicing alternativo (AS) explica cómo se obtiene una gran cantidad de proteínas a partir de una cantidad limitada de genes. Este proceso es afectado no sólo por la interacción de proteínas reguladoras del AS con sus secuencias blanco en los pre‐mRNAs sino que, dado que ocurre en íntimo contacto...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Muñoz, Manuel Javier
Otros Autores: Kornblihtt, Alberto R.
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2009
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4386_Munoz
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description El splicing alternativo (AS) explica cómo se obtiene una gran cantidad de proteínas a partir de una cantidad limitada de genes. Este proceso es afectado no sólo por la interacción de proteínas reguladoras del AS con sus secuencias blanco en los pre‐mRNAs sino que, dado que ocurre en íntimo contacto con la maquinaria transcripcional, es también afectado por ésta (acoplamiento transcripción/AS). Interesantemente, un gran número de genes involucrados en apoptosis son regulados por splicing alternativo produciendo mRNAs que codifican para proteínas con funciones antagónicas. Sin embargo poco se sabe sobre la regulación del AS en condiciones de estrés. En esta tesis se ha investigado cómo la respuesta al daño al DNA inducido por la luz UV provoca cambios en los patrones de AS de minigenes transfectados transitoriamente o de genes endógenos como Bcl‐x y caspasa 9. El UV induce la hiperfosforilación del dominio carboxilo terminal (CTD) de la RNA polimerasa II (pol II) y consecuentemente con esto afecta preferencialmente el AS co‐transcripcional. El efecto de UV es sistémico ya que el daño del DNA molde no es necesario y no involucra al factor de transcripción p53 como demostramos al utilizar células que carecen de éste clásico factor de respuesta a estrés. Utilizando la técnica de FRAP, en combinación con polimerasas mutantes en su CTD que imitan no sólo el estado hiperfosforilado sino también los efectos de la luz UV sobre el AS, demostramos que la hiperfosforilación del CTD inhibe la tasa de elongación de la pol II afectando así el acoplamiento entre la transcripción y el AS. Confirmando la relevancia de este mecanismo, la apoptosis inducida por luz UV en células p53‐/‐ es prevenida al revertir el cambio en el AS de Bcl‐x. Para evaluar la generalidad de nuestros resultados utilizamos microarrays de AS y encontramos que la irradiación con UV promueve una mayor proporción de cambios en AS en el grupo de genes donde también ha afectado su transcripción. Estos resultados sugieren que el acoplamiento entre la transcripción y el AS es clave en la respuesta al daño en el DNA.
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spelling tesis:tesis_n4386_Munoz2023-10-02T19:57:51Z Respuesta al daño al ADN : un ejemplo de acoplamiento entre transcripción y splicing alternativo Muñoz, Manuel Javier Kornblihtt, Alberto R. El splicing alternativo (AS) explica cómo se obtiene una gran cantidad de proteínas a partir de una cantidad limitada de genes. Este proceso es afectado no sólo por la interacción de proteínas reguladoras del AS con sus secuencias blanco en los pre‐mRNAs sino que, dado que ocurre en íntimo contacto con la maquinaria transcripcional, es también afectado por ésta (acoplamiento transcripción/AS). Interesantemente, un gran número de genes involucrados en apoptosis son regulados por splicing alternativo produciendo mRNAs que codifican para proteínas con funciones antagónicas. Sin embargo poco se sabe sobre la regulación del AS en condiciones de estrés. En esta tesis se ha investigado cómo la respuesta al daño al DNA inducido por la luz UV provoca cambios en los patrones de AS de minigenes transfectados transitoriamente o de genes endógenos como Bcl‐x y caspasa 9. El UV induce la hiperfosforilación del dominio carboxilo terminal (CTD) de la RNA polimerasa II (pol II) y consecuentemente con esto afecta preferencialmente el AS co‐transcripcional. El efecto de UV es sistémico ya que el daño del DNA molde no es necesario y no involucra al factor de transcripción p53 como demostramos al utilizar células que carecen de éste clásico factor de respuesta a estrés. Utilizando la técnica de FRAP, en combinación con polimerasas mutantes en su CTD que imitan no sólo el estado hiperfosforilado sino también los efectos de la luz UV sobre el AS, demostramos que la hiperfosforilación del CTD inhibe la tasa de elongación de la pol II afectando así el acoplamiento entre la transcripción y el AS. Confirmando la relevancia de este mecanismo, la apoptosis inducida por luz UV en células p53‐/‐ es prevenida al revertir el cambio en el AS de Bcl‐x. Para evaluar la generalidad de nuestros resultados utilizamos microarrays de AS y encontramos que la irradiación con UV promueve una mayor proporción de cambios en AS en el grupo de genes donde también ha afectado su transcripción. Estos resultados sugieren que el acoplamiento entre la transcripción y el AS es clave en la respuesta al daño en el DNA. Alternative splicing (AS) explains how a vast protein diversity is achieved with a limited number of genes and its regulation not only depends on the interaction of splicing factors with their target sequences in the pre‐mRNA but is coupled to RNA polymerase II (pol II) transcription. AS seems to play a key role in DNA damage response as suggested by the large number of apoptotic genes that are alternatively spliced, with often antagonistic roles of the isoforms generated. However, little is known about AS regulation in a DNA damage derived stress situation. In this thesis we show that ultraviolet (UV) radiation affects alternative splicing of transfected and endogenous genes like Bcl‐x and caspase 9 (C9). UV light induces the hyperphosphorylation of the carboxy terminal domain of the pol II and by doing so it affects co‐transcriptional AS preferentially. The UV effect is systemic as demonstrated by the fact that the actual damage of the DNA template in cis is not necessary and also p53 independent because it is observed in cells lacking this classic stress response factor. By using the FRAP technique and in combination with mutant polymerases that not only mimic the hyperphosphorylated state of its CTD but also the UV effect on AS, we demonstrated that the UV induced CTD hyperphosphorylation inhibits pol II transcriptional elongation rates which in turn affects AS decisions through its coupling with transcription. Confirming the relevance of this mechanism, apoptosis promoted by UV light in cells lacking p53 is prevented when the change in AS of the apoptotic gene Bcl‐x is reverted. To evaluate the generality of these results and using splicingsensitive microarrays, we found a significant overlap of the subsets of genes changing AS with UV light and those that also downregulate their expression, suggesting that transcription/AS coupling is a key feature of the DNA damage response. Fil: Muñoz, Manuel Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2009 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4386_Munoz

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