Mecanismo de unión a ADN del dominio C-terminal de la proteína E2 del papilomavirus humano, principal regulador de la expresión génica viral

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La interacción proteína-ADN juega un papel central en la fisiología celular. Dentro deéstas, se identifica al reconocimiento secuencia especifico con un rol regulatorio clave, pues deéstas interacciones depende la orquestación de los patrones de expresión génica de un organismo. Utilizando el domini...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal: Ferreiro, Diego Ulises
Otros Autores: Prat Gay, Gonzalo
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2003
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3638_Ferreiro
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Confiamos en que la interpretaciónde éstos en términos termodinámicos provee un marco para relacionar las estructuras proteicascon su funcionalidad biológica Caracterizamos un mecanismo de unión E2c-ADN al equilibrio en el cual E2c presentados modos diferentes de unión de ADN diferentes. Estos modos resultan estarestrechamente relacionados con la ocurrencia de poblaciones conformacionales del estado plegadode E2c. Mostramos ademas que ésto no sucede en un homólogo cercano con el quecomparte una alta identidad de secuencia y una topología de plegamiento idéntica, sugiriendoque ésto puede estar relacionado con los distintos roles funcionales que E2c presenta. El camino cinétíco de interacción E2c-ADN se inicia con una colisión rápida, limitadapor la difusión de las macromoléculas en solución. Esto da lugar a un "complejo de encuentro"estabilizado por interacciones electrostáticas, en el cual E2c tiene la posibilidad de deslizarsesobre la doble hélice. Si el ADN contiene un sitio E2, el complejo sufre fuertes rearreglos conformacionalesque, luego de una fase de expulsión de solvente. resultan en la formación de uncomplejo estable proteina:ADN. Este último paso involucra un ocultamiento de superficie accesibleal solvente y es allí donde se consolidan las interacciones cercanas aminoácido-base. Experimentos de doble-mezcla por flujo detenido nos permitieron asignar el orden secuencialde los rearreglos y demostrar que la unión puede también proceder por una ruta macroscópicaparalela. caracterizada como de dos estados. Utilizando una estrategia de mutagénesis sitio-dirigida realizamos un mapeoenergético de la interfase de unión. Pudimos asignar las contribuciones que cada residuo realiza, en forma aditiva, a la energía libre de asociación. Las asignaciones energéticas resultaronestar en excelente concordancia con las estructuras de alta resolución, y correlacionan con elcarácter altamente dinámico de la interfase de asociación. Lon conjuntos de estados de transición del camino cinético fueron analizados con 23mutantes sitio-dirigidas. Esto nos permitió disectar las contribuciones energéticas de los residuosindependientes a nivel atómico e inferir los cambios conformacionales que ocurren durantelas etapas de unión y reconocimiento de secuencia. Mostramos que la plasticidad estructuralque E2c presenta está íntimamente ligada a su capacidad de reconocimiento sitio-específico. Por último, presentamos un modelo funcional plausible de regular la actividad biológicade E2c y su capacidad de reconocimiento de secuencias de ADN. Protein-DNA interactions play a central role in cellular physiology. Within these, site specificrecognition is a primary topic that underprints the expression profile of whole genomes. Although many biological aspects of these non-covalent interactions are becoming clearer,detailed biophysical understanding of site specific recognition is lacking. Using the human papilomavirus (HPV) E2c transcription factor as a model system we aim a physicochemical dissectionof its DNA binding properties. We set-up an spectroscopic binding essay, readily done insolution, which allowed us to quantify DNA binding parameters in energetic terms, detect conformationalchanges exerted on both macromolecules upon binding and relate them to the highresolution structures available. We characterized an equilibrium DNA binding mechanism where the HPV-16 E2cdomain is capable of two distinct binding modes, which correspond to different conformationalensembles of the E2c molecule. Despite having a strong sequence identity and an identical foldingtopology, a close homolog does not show this behaviour under the same experimental conditions. The differences observed may be related to the distinctive transcriptional roles in whichthese proteins are involved. The kinetic DNA-binding mechanism is initiated by the diffusion controlled formation ofan encounter complex stabilized by electrostatic interactions, in which E2c has the possibility toslide along the DNA duplex. If the target DNA contains an E2-binding site, substantial conformationalrearrangements take place, and a solvent exclusion step leads to the formation of a highlystable protein-DNA complex. This last step involves the largest burial of surface area from theinterface and the direct readout of the DNA bases is proposed to occur. Double-Jump stoppedflow experiments allowed us to characterize the sequence of intermediate events and demonstratethat a last-formed final complex can be formed through a parallel two-state macroscopicroute. An extensive site-directed mutagenesis analysis over the entire DNA binding reglonled us assign the energetic contributions of individual sidechains to the overall binding free energy. We show that each sidechain contribute in a small amount to the total free energy in anadditive way. These contributions are in excelent agreement with the high resolution structuresand correlate with the highly dynamic character of the interface. The transition state ensembles of the kinetic binding pathway were probed with 23site-directed mutants. This led us to dissect the sidechain energetic contributions at almostatomic resolution, and infer the conformational changes that take place in each kinetic event. We show that the conformational plasticity this protein presents is intimately linked to its DNArecognition capacity. Finally, a plausible biological model for functional E2c regulation and specific DNArecognition is presented. Fil: Ferreiro, Diego Ulises. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2003 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3638_Ferreiro

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