Clonado y caracterización de proteínas relacionadas al control del ciclo celular del parásito Trypanosoma cruzi
En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínasque se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). Enel presente trabajo de tesis se caracterizaron...
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2002
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| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3486_Santori |
| Aporte de: |
| Sumario: | En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínasque se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). Enel presente trabajo de tesis se caracterizaron y clonaron proteínas candidatas a participaren el control del ciclo celular de T. cruzi. Se secuenciaron en su totalidad los fragmentos de los genes obtenidos por doblehíbrido y se los denominó TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Además se clonaron los genescompletos y se secuenciaron. La secuencia predicha para las tres proteinas mostrósimiltud con ciclinas denominadas PHO, presentes en S. cerevisiae. TzCYC5 posee unaregión rica en histidinas próxima al amino terminal. Se determinó que los tres genes sonde copia única mediante Southern blot y por rastreo de una biblioteca genómica. Laexpresión de los tres genes mostró variaciones particulares en distintos estadios de T.cruzi. TzCYC6 complementó una cepa mutante de S. cerevisiae, deficiente en las ciclinasde G1, demostrando que es una ciclina funcional. Se determinó el patrón de expresión de TzCRK3 en estadíos de T. cruzi. El ARNmde TzCRK3 es más abundante en el estadío amastigotes que en epimastigotes otripomastigotes. Se obtuvo un suero específico contra TzCRK3, inmunizando conejos conla proteína recombinante expresada en bacterias. Ensayos de Western blot mostraron, enepimastigotes la presencia de una proteína del peso molecular esperado, 35 kDa. Enamastigotes y tripomastigotes, se observaron bandas específicas de menor movilidad. Seestableció que la proteina identificada en epimastigotes se asocia a p13ˢͧͨ¹-agarosa,proteína con alta afinidad por CDK1. TzCRK3 endógena mostró actividad quinasa dehistona H1 y fue inhibida por inhibidores de CDKs: flavopiridol, roscovitina y olomoucina. Flavopiridol inhibió el crecimiento de epimastigotes en cultivo, aunque no en forma total. La actividad quinasa de la TzCRK3 de dichos epimastigotes se inhibió en forma dosisdependiente. La actividad de quinasa de histona H1 asociada a p13ˢͧͨ¹ mostró las mismasvariaciones estadío especificas y similar sensibilidad a los CK1s que TzCRK3. En loscultivos con flavopiridol el IC50 no mostró diferencias significativas con el de TzCRK3. Laactividad de TzCRK3 en epimastigotes sincronizados mostró un pico en G2/M mientrasque la actividad asociada a p13ˢͧͨ¹ aumentó al mismo tiempo pero no disminuyó hasta M. La expresión de TzCRK3 fue constante. Los patrones de actividad y expresión de TzCRK3son tipicos de una CDK. Esta evidencia indica que TzCRK3 está involucrada en el controldel ciclo celular de T. cruzi, controlando el pasaje de G2/M, aunque no se puede excluir lapresencia de otra CDK. Se identificó un EST con alta similitud de secuencia con Lmmp12ͨᴷˢ¹, el genhomólogo a p13ˢͧͨ¹ en Leishmania mexicana. Se clonó el gen completo y se determinó quees copia única. La secuencia esperada de la proteína muestra una alta identidad desecuencia con la familia de proteinas CKS. Su expresión mostró variaciones estadíoespecificas. La proteina recombinante se expresó en bacterias, en fusión a histidinas, sela purificó y se inmunizaron conejos para obtener un anti suero. |
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