Clonado y caracterización de proteínas relacionadas al control del ciclo celular del parásito Trypanosoma cruzi

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En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínasque se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). Enel presente trabajo de tesis se caracterizaron...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Santori, María Isabel
Otros Autores: Téllez-Iñón, María Teresa
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2002
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3486_Santori
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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spelling tesis:tesis_n3486_Santori2023-10-02T19:49:23Z Clonado y caracterización de proteínas relacionadas al control del ciclo celular del parásito Trypanosoma cruzi Santori, María Isabel Téllez-Iñón, María Teresa En nuestro laboratorio se clonaron dos CRKs (CDK1 Related Kinases) de T. cruzi, TzCRK1 y TzCRK3 (Gómez y col., 1998) y se identificaron, por doble híbrido, proteínasque se asocian a TzCRK1 con similitud a una familia de ciclinas (Gómez y col., 2001). Enel presente trabajo de tesis se caracterizaron y clonaron proteínas candidatas a participaren el control del ciclo celular de T. cruzi. Se secuenciaron en su totalidad los fragmentos de los genes obtenidos por doblehíbrido y se los denominó TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Además se clonaron los genescompletos y se secuenciaron. La secuencia predicha para las tres proteinas mostrósimiltud con ciclinas denominadas PHO, presentes en S. cerevisiae. TzCYC5 posee unaregión rica en histidinas próxima al amino terminal. Se determinó que los tres genes sonde copia única mediante Southern blot y por rastreo de una biblioteca genómica. Laexpresión de los tres genes mostró variaciones particulares en distintos estadios de T.cruzi. TzCYC6 complementó una cepa mutante de S. cerevisiae, deficiente en las ciclinasde G1, demostrando que es una ciclina funcional. Se determinó el patrón de expresión de TzCRK3 en estadíos de T. cruzi. El ARNmde TzCRK3 es más abundante en el estadío amastigotes que en epimastigotes otripomastigotes. Se obtuvo un suero específico contra TzCRK3, inmunizando conejos conla proteína recombinante expresada en bacterias. Ensayos de Western blot mostraron, enepimastigotes la presencia de una proteína del peso molecular esperado, 35 kDa. Enamastigotes y tripomastigotes, se observaron bandas específicas de menor movilidad. Seestableció que la proteina identificada en epimastigotes se asocia a p13ˢͧͨ¹-agarosa,proteína con alta afinidad por CDK1. TzCRK3 endógena mostró actividad quinasa dehistona H1 y fue inhibida por inhibidores de CDKs: flavopiridol, roscovitina y olomoucina. Flavopiridol inhibió el crecimiento de epimastigotes en cultivo, aunque no en forma total. La actividad quinasa de la TzCRK3 de dichos epimastigotes se inhibió en forma dosisdependiente. La actividad de quinasa de histona H1 asociada a p13ˢͧͨ¹ mostró las mismasvariaciones estadío especificas y similar sensibilidad a los CK1s que TzCRK3. En loscultivos con flavopiridol el IC50 no mostró diferencias significativas con el de TzCRK3. Laactividad de TzCRK3 en epimastigotes sincronizados mostró un pico en G2/M mientrasque la actividad asociada a p13ˢͧͨ¹ aumentó al mismo tiempo pero no disminuyó hasta M. La expresión de TzCRK3 fue constante. Los patrones de actividad y expresión de TzCRK3son tipicos de una CDK. Esta evidencia indica que TzCRK3 está involucrada en el controldel ciclo celular de T. cruzi, controlando el pasaje de G2/M, aunque no se puede excluir lapresencia de otra CDK. Se identificó un EST con alta similitud de secuencia con Lmmp12ͨᴷˢ¹, el genhomólogo a p13ˢͧͨ¹ en Leishmania mexicana. Se clonó el gen completo y se determinó quees copia única. La secuencia esperada de la proteína muestra una alta identidad desecuencia con la familia de proteinas CKS. Su expresión mostró variaciones estadíoespecificas. La proteina recombinante se expresó en bacterias, en fusión a histidinas, sela purificó y se inmunizaron conejos para obtener un anti suero. In our laboratry two CRK genes: TzCRK1 and TzCRK3 from T. cruzi werepreviously isolated (Gómez et al., 1998), and using the yeast two-hybrid system openreading frames coding for proteins able to associate with TzCRK1 were identified (Gómez et al, 2001). Positive clones obtained in the two hybrid screen were sequenced andcompared in data banks. Clones sharing identity with S. cerevisiae PHO cyclins werenamed TzCYC4, TzCYC5 y TzCYC6. Full lenght genes were cloned and sequenced. Identity with proteins from the PHO family was still observed when the predictedaminoacidic sequences were compared. An histidine-rich domain was observed in the TzCYC5 amino terminal region. All three genes were shown to be single copy. CyclinsmRNA levels varied in a stage specific manner. TzCYC6 was able to functionallycomplement a S. cerevisiae deficient for G1 cyclins. To establish if TzCRK3 has a role in the regulation of the parasite cell cycle,its expression and activity were studied. Northern and Western blot analyses detectedthe enzyme in three forms of the parasite; mRNA levels, subcellular localization andapparent molecular weight of the protein varied throughout the stages. TzCRK3 fromepimastigote soluble extracts interacted with p13ˢͧͨ¹-beads. Endogenous TzCRK3phosphorylated histone H1 and this activity was inhibited by specific CDK inhibitors (CKIs): olomoucine, flavopiridol and roscovitine. In addition, p13ˢͧͨ¹ beads coprecipitatedwith a kinase activity that was inhibited by the CDK inhitors mentionedabove. Flavopiridol partially inhibited the growth of T. cruzi epimastigotes at 50 nM,the lowest concentration used, but even with the highest (5 mM), cell growth was notcompletely arrested. TzCRK3 from flavopiridol inhibited epimastigotes extractsexhibited a dose dependent inhibition of histone H1 phosphorylation. T. cruziˢͧͨ¹- binding CRK displayed the same inhibition profile. TzCRK3 IC50 did not significativelydiffered from the shown by the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹. This indicatesthat TzCRK3 is the enzyme responsible for the majority of the kinase activityassociated to p13ˢͧͨ¹. TzCRK3 activity of hydroxyurea (HU) synchronizedepimastigotes peaked in G2/M boundary while the kinase activity associated to p13ˢͧͨ¹beads increased at the same time point but remained high until late G2/M. In addition, TzCRK3 expression was constant along the cell cycle. This is a common pattern of CDK activity regulation. Taken together, these results contribute to support the ideathat TzCRK3 is involved in control of the cell cycle in T. cruzi. A T. cruzi EST sharing high identity values with the Leishmania mexicanap13ˢͧͨ¹ homologous, Lmmp12ͨᴷˢ¹ was identified. The full lenght gene was cloned. Thepredicted aminoacidic sequence showed high identity scores with proteins belongingto the CKS family. This protein was named Tzp12ͨᴷˢ¹. mARN levels in different stagesof the parasite varied. The recombinant protein, fused to a histidine tag, wasexpressed in bacteria. It was purified and used to immunize rabbits, in order to obtaina specif antibody. Fil: Santori, María Isabel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2002 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3486_Santori

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