Mecanismos de señalización inducidos por el factor de crecimiento y transformación Beta 1 (TGF beta sub 1), en fibroblastos de ratón Swiss 3T3
La superfamilia del TGFβ está formada por polipéptidos que regulan diferencialmente ladivisión celular, en mamíferos. Dependiendo del tipo celular, el TGFβ1 puede inhibir, promover opotenciar la división celular. En monocapas confluentes y aquietadas de la línea celular Swiss 3T3, el TGFβ1 (O,5—2 ng...
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| Lenguaje: | Español |
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Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2000
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TGF BETA1 PKC TPA CICLO CELULAR MECANISMOS DE SEÑALIZACION PGF2ALFA SWISS 3T3 TGFBETA1 PKC TPA CELL CYCLE SIGNALLING MECHANISMS PGF2ALFA SWISS 3T Cadenas, María Belén Mecanismos de señalización inducidos por el factor de crecimiento y transformación Beta 1 (TGF beta sub 1), en fibroblastos de ratón Swiss 3T3 |
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La superfamilia del TGFβ está formada por polipéptidos que regulan diferencialmente ladivisión celular, en mamíferos. Dependiendo del tipo celular, el TGFβ1 puede inhibir, promover opotenciar la división celular. En monocapas confluentes y aquietadas de la línea celular Swiss 3T3, el TGFβ1 (O,5—2 ng/ml) no induce, ni inhibe la proliferación celular. Sin embargo, estefactor es capaz de potenciar la proliferación inducida por la PGF2α (300 ng/ml) [Gómez de Alzagaet aL., 1994]. De las señales activadas por la PGF2α, se buscó cúales eran las más importantes en lasinergia con el TGFβ1. Se comenzó estudiando la quinasa C (PKC), a través de la retromodulacióncon 12-tetradecanoilforbol l3-acetato (TPA, 800 nM, 96 hs.), o Briostatina l (lOOnM, 96 hs.). En la condición de retro-modulación de la PKC, se observó que el TGFβ1 (1,0ng/ml) era capaz de inducir la proliferación celular (50 % de células en fase S, después de 28 hs.de estimulación, y 50 % de aumento en el número de células, después de 48 hs. de estimulación),siendo ésta dependiente, tanto de la concentración del factor, como de la concentración de loscompuestos que retro-modulan la PKC. En las células pretratadas con TPA, la fase G1 tiene unas 6 a 7 horas más, que en las células sin pretratar. En la primer condición, el TGFβ1 induce laexpresión de la ciclina D1, y en correlación a la mayor duración de la fase G1, ocurre horas mástarde después de la estimulación (lO-12 hs.), comparado con las células sin pretratar, estimuladascon PGF2α (6-9 hs.) [Sauane et al., 2000]. Fue interesante observar, que la PGF2α, induce laexpresión de la ciclina Dl, en células pretratadas con TPA, aún cuando en esta condición no esmitogénica, y a pesar que la CDK4 se halle presente. Este resultado lleva a plantear que laexpresión de la ciclina Dl, no necesariamente indica que la célula se dividirá, y además que esindependiente de la PKC. Con el uso del anticuerpo monoclonal anti PKCα [Leach et al., 1988], seobservó que esta enzima está ausente en el momento de agregado el TGFβ1, en célulaspretratadas con TPA. La inhibición directa de la PKC con el inhibidor específico GF 109203X (1O μM), agregado una hora antes a células sin pretratar, no fue suficiente para permitir que el TGFβ1 indujera la mitogénesis. El GF es capaz de inhibir parcialmente la sinergia entre el TGFβ1y la PGF2α, mientras que inhibe totalmente la sinergia entre el TGFβ1 y el OAG, en células sinpretratar. Es decir que la PKC no es suficiente, pero sí necesaria en la primer sinergia, y sí muyimportante en la última. El agregado de GF por períodos prolongados, no logra retro-modular la PKC. Los receptores del TGFβ1, detectados con el uso de anticuerpos, están presentes en ambascondiciones, y la medición del transporte de glucosa, inducido por este factor, pone en evidenciaque la actividad de los mismos, no se ve alterada por el pretratamiento con TPA. El agregado deácido okadaico (5 nM), junto al TGFβ1, en células sin pretratar, induce la síntesis de ADN (lO %de células en fase S), indicando la presencia de fosfatasas de ser/thr, pero no sería el únicoimpedimento, por el cual el TGFβ1 no es mitogénico en las células Swiss 3T3. En el estudio delas sinergias del TGFβ1 con insulina y PGE1, se observó que, en células pretratadas con TPA, PGE1 no induce la proliferación, ni potencia la inducción de esta última por el TGFβ1 solo oagregado con insulina. De estos resultados se concluye, que la PKC es necesaria para que la PGE1 potencie la sinergia entre el TGFβ1 más insulina. La falta de potenciación entre el TGFβ1 yla PGE1, podría indicar un camino de señalización en común. Inhibiendo la PKA con PKI,péptido inhibidor (l nM), y también con el uso del inhibidor H-89 (l nM), se encontró que lainhibición de esta enzima no altera la inducción de la proliferación por el TGFβ1, en célulaspretratadas con TPA. Con el uso del inhibidor genisteina (10 μM), se observó que las quinasas detirosina están involucradas en la sinergia del TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones, y en lainducción de la proliferación por el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. El uso de lovastatina (80 μM) y mevalonato (800 μM), puso en evidencia la importancia relativa de la isoprenilaciónde proteínas, en la sinergia entre el TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones. El TGFβ1 no activala MAPK (ERK 1/2) en ninguna condición, ni potencia la actividad, ni la presencia de la misma,en la sinergia con la PGF2α. La actividad de esta enzima se midió, a través de lainmunoprecipitación y fosforilación de la mielina básica, y con el anticuerpo anti ERK 1/2,bifosforilado (forma activa). El TGFβ1 induce la translocación de la Smad4 (medida porinmunoflourescencia, con anticuerpo anti Smad4), en ambas condiciones, y ésta no se ve alteradaen las sinergias de este factor y la PGF2α. En conclusión, el TGFβ1 induce la proliferación celularen células Swiss 3T3, que han sido pretratadas con compuestos capaces de retro-modular la PKC,es decir, primero activada y luego degradada. La inducción de la ciclina Dl, debe ocurrir por unavía alternativa a ERK l y 2. El pretratamiento con TPA lleva a las células a una fase G0 diferentede la misma fase en la que se encuentran las células confluentes y aquietadas, sin pretratar. El TGFβ1 activa las moléculas señalizantes específicas de su camino de señalización, y éstas debeninteraccionar con factores de transcripción u otros compuestos, que surgen por el pretratamientocon TPA, haciendo que la fase G1 sea más larga, tiempo en el cual se sintetizan y/o modificancompuestos necesarios para inducir la proliferación celular. |
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Jiménez de Asúa, Luis Cadenas, María Belén |
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tesis:tesis_n3296_Cadenas2023-10-02T19:47:05Z Mecanismos de señalización inducidos por el factor de crecimiento y transformación Beta 1 (TGF beta sub 1), en fibroblastos de ratón Swiss 3T3 Signalling mechanisms induced by transforming growth factor beta 1 (TGF Beta sub1), in Swiss 3T3 fibroblasts Cadenas, María Belén Jiménez de Asúa, Luis Ielpi, Luis TGF BETA1 PKC TPA CICLO CELULAR MECANISMOS DE SEÑALIZACION PGF2ALFA SWISS 3T3 TGFBETA1 PKC TPA CELL CYCLE SIGNALLING MECHANISMS PGF2ALFA SWISS 3T La superfamilia del TGFβ está formada por polipéptidos que regulan diferencialmente ladivisión celular, en mamíferos. Dependiendo del tipo celular, el TGFβ1 puede inhibir, promover opotenciar la división celular. En monocapas confluentes y aquietadas de la línea celular Swiss 3T3, el TGFβ1 (O,5—2 ng/ml) no induce, ni inhibe la proliferación celular. Sin embargo, estefactor es capaz de potenciar la proliferación inducida por la PGF2α (300 ng/ml) [Gómez de Alzagaet aL., 1994]. De las señales activadas por la PGF2α, se buscó cúales eran las más importantes en lasinergia con el TGFβ1. Se comenzó estudiando la quinasa C (PKC), a través de la retromodulacióncon 12-tetradecanoilforbol l3-acetato (TPA, 800 nM, 96 hs.), o Briostatina l (lOOnM, 96 hs.). En la condición de retro-modulación de la PKC, se observó que el TGFβ1 (1,0ng/ml) era capaz de inducir la proliferación celular (50 % de células en fase S, después de 28 hs.de estimulación, y 50 % de aumento en el número de células, después de 48 hs. de estimulación),siendo ésta dependiente, tanto de la concentración del factor, como de la concentración de loscompuestos que retro-modulan la PKC. En las células pretratadas con TPA, la fase G1 tiene unas 6 a 7 horas más, que en las células sin pretratar. En la primer condición, el TGFβ1 induce laexpresión de la ciclina D1, y en correlación a la mayor duración de la fase G1, ocurre horas mástarde después de la estimulación (lO-12 hs.), comparado con las células sin pretratar, estimuladascon PGF2α (6-9 hs.) [Sauane et al., 2000]. Fue interesante observar, que la PGF2α, induce laexpresión de la ciclina Dl, en células pretratadas con TPA, aún cuando en esta condición no esmitogénica, y a pesar que la CDK4 se halle presente. Este resultado lleva a plantear que laexpresión de la ciclina Dl, no necesariamente indica que la célula se dividirá, y además que esindependiente de la PKC. Con el uso del anticuerpo monoclonal anti PKCα [Leach et al., 1988], seobservó que esta enzima está ausente en el momento de agregado el TGFβ1, en célulaspretratadas con TPA. La inhibición directa de la PKC con el inhibidor específico GF 109203X (1O μM), agregado una hora antes a células sin pretratar, no fue suficiente para permitir que el TGFβ1 indujera la mitogénesis. El GF es capaz de inhibir parcialmente la sinergia entre el TGFβ1y la PGF2α, mientras que inhibe totalmente la sinergia entre el TGFβ1 y el OAG, en células sinpretratar. Es decir que la PKC no es suficiente, pero sí necesaria en la primer sinergia, y sí muyimportante en la última. El agregado de GF por períodos prolongados, no logra retro-modular la PKC. Los receptores del TGFβ1, detectados con el uso de anticuerpos, están presentes en ambascondiciones, y la medición del transporte de glucosa, inducido por este factor, pone en evidenciaque la actividad de los mismos, no se ve alterada por el pretratamiento con TPA. El agregado deácido okadaico (5 nM), junto al TGFβ1, en células sin pretratar, induce la síntesis de ADN (lO %de células en fase S), indicando la presencia de fosfatasas de ser/thr, pero no sería el únicoimpedimento, por el cual el TGFβ1 no es mitogénico en las células Swiss 3T3. En el estudio delas sinergias del TGFβ1 con insulina y PGE1, se observó que, en células pretratadas con TPA, PGE1 no induce la proliferación, ni potencia la inducción de esta última por el TGFβ1 solo oagregado con insulina. De estos resultados se concluye, que la PKC es necesaria para que la PGE1 potencie la sinergia entre el TGFβ1 más insulina. La falta de potenciación entre el TGFβ1 yla PGE1, podría indicar un camino de señalización en común. Inhibiendo la PKA con PKI,péptido inhibidor (l nM), y también con el uso del inhibidor H-89 (l nM), se encontró que lainhibición de esta enzima no altera la inducción de la proliferación por el TGFβ1, en célulaspretratadas con TPA. Con el uso del inhibidor genisteina (10 μM), se observó que las quinasas detirosina están involucradas en la sinergia del TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones, y en lainducción de la proliferación por el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. El uso de lovastatina (80 μM) y mevalonato (800 μM), puso en evidencia la importancia relativa de la isoprenilaciónde proteínas, en la sinergia entre el TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones. El TGFβ1 no activala MAPK (ERK 1/2) en ninguna condición, ni potencia la actividad, ni la presencia de la misma,en la sinergia con la PGF2α. La actividad de esta enzima se midió, a través de lainmunoprecipitación y fosforilación de la mielina básica, y con el anticuerpo anti ERK 1/2,bifosforilado (forma activa). El TGFβ1 induce la translocación de la Smad4 (medida porinmunoflourescencia, con anticuerpo anti Smad4), en ambas condiciones, y ésta no se ve alteradaen las sinergias de este factor y la PGF2α. En conclusión, el TGFβ1 induce la proliferación celularen células Swiss 3T3, que han sido pretratadas con compuestos capaces de retro-modular la PKC,es decir, primero activada y luego degradada. La inducción de la ciclina Dl, debe ocurrir por unavía alternativa a ERK l y 2. El pretratamiento con TPA lleva a las células a una fase G0 diferentede la misma fase en la que se encuentran las células confluentes y aquietadas, sin pretratar. El TGFβ1 activa las moléculas señalizantes específicas de su camino de señalización, y éstas debeninteraccionar con factores de transcripción u otros compuestos, que surgen por el pretratamientocon TPA, haciendo que la fase G1 sea más larga, tiempo en el cual se sintetizan y/o modificancompuestos necesarios para inducir la proliferación celular. TGFβ is a superfamily of polypeptides that can differencially regulate mammalian celldivision. Depending upon TGFβ1 interaction with various cell types, its action can causeinhibition, promotion, as well as potentiation of cell division. In confluent resting Swiss 3T3cells, TGFβ1 (0,5-2 ng/ml) neither not induce, nor inhibits cellular proliferation. However, thisfactor enhances PGF2α (300 ng/ml) proliferative response, in this cell type [Gómez de Alzaga et al, 1994]. Of PGF2α-induced signalling activities, our endeavour was focused in to those involved inthe synergy with TGFβ1. The first activity studied was protein kinase C (PKC), through it's “down-modulation” either with the phorbol ester, 12-tetradecanoylphorbol l3-acetate (TPA, 800nM, 96 hs), or Bryostatin 1 (100 nM, 96 hs). In PKC “down-modulated” cells, TGFβ1 can induceentry in S phase (50 % of cells in S phase, after 28 hs of stimulation, and 50 % more cells, upon 48 hs of stimulation), being dependent upon factor concentration, as well as on PKC-“down-modulating”compounds concentration. In TPA-treated cells, the G1 phase is of 6 to 7 hs more,than cells without treatment. In the first condition, TGFβ1 induced cyclin D1 expression, and incorrelation with the G1 phase extension time, this expression occurs hours latter after stimulation (10-12 hs), compared with cells without treatment, stimulated with PGF2α (6-9 hs) [Sauane et al., 2000]. It was interesting to observe that PGF2α induced cyclin D1 expression in TPA-treated cells,eventhough in this condition failed to induce mitogenesis, and even with CDK4 presence. Thisresults implie that cyclin D1 expression, does not necessarily indicate that cells are going todivide, and that such event is independent of PKC activity. Using monoclonal antibody anti PKCα [Leach et al., 1988], we reveal that this enzyme is absent upon TGFβ1 addition, in TPA-treatedcells. PKC direct inhibition with GF 109203X (10 μM), PKC-specific inhibitor, added 1hour prior to cells without treatment, was not enough to allow TGFβ1 induce mitogenesis. GFinhibited parcially the synergy between TGFβ1 and PGF2α, and prevent totally the action between TGFβ1 and OAG, in cells without treatment. Thus, PKC is not sufficient, but yet necessary in thefirst synergy, and important in the last one. GF added for long periods of time, is not capable ofdown-modulates PKC. TGFβ1 receptors, detected by antibodies, are present in both conditions,and glucose transport measurements, induced by this factor, puts in evidence, that receptoractivities are not altered by TPA treatment. Okadaic acid (5 nM) added with TGFβ1, in cellswithout treatment, induce DNA synthesis (10 % of cells in S phase), indicating the existence ofser/thr phosphatases. However, this would not be the only retrain for TGFβ1 to inducemitogenesis in Swiss 3T3 cells. In the synergies study between TGFβ1, insulin and PGE1, it wasobserved that in TPA-treated cells, PGE1 neither induce proliferation, nor enhances TGFβ1action, added without or with insulin. From this findings we conclude that PKC is necessary for PGE1 to enhance the synergy between TGFβ1 and insulin. The lack of synergy between PGE1 and TGFβ1, may indicate that they share common signalling pathways. PKA inhibited using PKI (1nM), peptide inhibitor, and H-89 (1 nM) inhibitor, reveal that this activity is not involved in TGFβ1-induced proliferation, in TPA-treated cells. The use of inhibitor Genistein (10 μM),enable to show that tirosine kinases activities might be involved in the synergy between TGFβ1and PGF2α, in both conditions, as well as for the TGFβ1-induced proliferation in TPA-treatedcells. Using lovastatin (80 μM) and mevalonate (800 μM), indicated the relative importance ofprotein isoprenylation in the synergy between TGFβ1 and PGF2α, under both conditions. TGFβ1did not activate MAPK (ERKl/2) in any condition, nor enhanced it's activity or presence in thesynergy between PGF2α. MAPK activity measured by immunoprecipitation and phosphorylationof myelin basic protein, as well as by immunodetection with antibody anti ERK 1/2biphosphorylated (active form). Thus, this results indicated that MAPK activity was induced onlyby PGF2α, and was not altered by TGFβ1 addition. Smad4 translocation induced specifically by TGFβ1 (measured by immunofluorescence with antibody anti Smad4), in both conditions, is notaltered in the synergy with PGF2α. We conclude that TGFβ1 induces proliferation in Swiss 3T3cells, whose PKC had been “down-modulated” by specific compounds, thus, first activated andthen degraded. Cyclin D1 induction by TGFβ1 may occurs via an alternative mechanisms to ERK 1/2 action. TPA treatment leave the cells in a different G0 state, compared with the same state inwhich confluent and resting Swiss 3T3 cells are. TGFβ1 activated its specific signallingmolecules, and this ones may interact with transncription factors or other compounds, whichappeared by TPA treatment, thus lengthening G1 phase duration, required for the synthetisisand/or modification of compounds necessaries to induce cellular multiplication. Fil: Cadenas, María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2000 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3296_Cadenas |