Clonado, organización genómica y expresión de la glutamato dehidrogenasa NADP dependiente (GluDH-NADP) de Trypanosoma Cruzi

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Epimastigotes de Trypanosoma cruzi, el protozoo parásito que causa la enfermedad de Chagas, contienen dos glutamato dehidrogenasas diferentes (GluDHs), NAD y NADPdependientes. En este sentido los parásitos se asemejan a las bacterias, hongos y plantasy se diferencian de animales superiores que posee...

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Autor principal: Barderi, Patricia Alejandra
Otros Autores: Cazzulo, Juan José
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1998
Materias:
TRYPANOSOMA CRUZI
GLUTAMATO DEHIDROGENASA NADPH DEPENDIENTE
CATABOLISMO DE AMINOACIDOS
PURIFICACION
SECUENCIACION DE ADN
COMPARACION DE SECUENCIAS
SECUENCIACION DE PROTEINAS
NADP-LINKED GLUTAMATE DEHYDROGENASE
AMINO ACID CATABOLISM
PURIFICATION
DNA SEQUENCING
SEQUENCE COMPARISION
PROTEIN SEQUENCING
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3065_Barderi
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Clonado, organización genómica y expresión de la glutamato dehidrogenasa NADP dependiente (GluDH-NADP) de Trypanosoma Cruzi
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description Epimastigotes de Trypanosoma cruzi, el protozoo parásito que causa la enfermedad de Chagas, contienen dos glutamato dehidrogenasas diferentes (GluDHs), NAD y NADPdependientes. En este sentido los parásitos se asemejan a las bacterias, hongos y plantasy se diferencian de animales superiores que poseen sólo una enzima inespecífica paracoenzima. La GluDH-NADP dependiente (EC 1.4.1.4) es un hexámero formado porsubunidades idénticas de 47kDa, mostrando ser muy semejante a la correspondienteenzima de E. coli en cuanto a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal. Laforma NADP dependiente podría ser biosintética mientras la forma NAD dependientepodría tener un rol catabólico. La GluDH-NADP dependiente fue purificada a homogeneidad proteica a partir deepimastigotes de Trypanosoma cruzi mediante un protocolo mejorado que incluyecromatografía de afinidad en Blue Sepharose. Se determinó la secuencia de aminoácidosde 11 péptidos internos, obtenidos por digestión con BrCN, tripsina, endopeptidasa Arg-Co endopeptidasa Lys-C. Dichas secuencias, correspondientes aproximadamente al 30%de la molécula, mostraron una identidad del 74% con la enzima similar de E. coli. Utilizandoun suero policlonal monoespecífico producido contra la proteína purificada se realizó elrastreo de una biblioteca de expresión genómica de T. cruzi en el vector λgt11. De estaforma pudo seleccionarse un único clon conteniendo 270 pb correspondientes al extremo 3' del gen que fue secuenciado completamente. Reacciones de PCR usando iniciadoresconstruídos de acuerdo a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la enzimamadura y con la secuencia del clon correspondiente al extremo C-terminal pudieronclonarse y secuenciarse dos ORFs completos (TcGluDH1 y TcGluDH2). Las secuenciasobtenidas muestran mayor homología con la enzima de Escherichia coli (70-72% deidentidad), y menor homologia (52-57%)con la correspondiente enzima de eucariontesinferiores. A partir de la secuencia de ADN se predijo una proteína que contiene 446aminoácidos. Usando el gen TcGluDH1 como sonda se realizaron experimentos de Southern blot, usando fragmentos de restricción o cromosomas enteros separados porelectroforesis en campo pulsado, indicando variaciones entre los diferentes clones y cepasde parásitos, sugiriendo la presencia de varios genes codificando para la GluDH-NADP. Laexpresión de la enzima resultó ser diferente en los distintos estadíos del desarrollo. Laforma epimastigote presenta mayor cantidad de ARNm y proteína (a juzgar por la actividadenzimática y ensayos de Western blot), en comparación con otras formas del parásito. Elgen clonado TcGluDH1 fue expresado en E. coli, produciendo una enzima recombinanteactiva con constantes cinéticas similares a la enzima natural. A pesar de que las evidenciasbioquímicas sugieren que la enzima se localiza tanto en el citoplasma como en lamitocondria, nuestros resultados indican una localización exclusivamente citosólica parala GluDH-NADP.
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spelling tesis:tesis_n3065_Barderi2023-10-02T19:44:19Z Clonado, organización genómica y expresión de la glutamato dehidrogenasa NADP dependiente (GluDH-NADP) de Trypanosoma Cruzi Cloning, genomic organization and expression of the NADP-dependent glutamate dehydrogenase (NADP-GluDH) of Trypanosoma cruzi Barderi, Patricia Alejandra Cazzulo, Juan José TRYPANOSOMA CRUZI GLUTAMATO DEHIDROGENASA NADPH DEPENDIENTE CATABOLISMO DE AMINOACIDOS PURIFICACION SECUENCIACION DE ADN COMPARACION DE SECUENCIAS SECUENCIACION DE PROTEINAS TRYPANOSOMA CRUZI NADP-LINKED GLUTAMATE DEHYDROGENASE AMINO ACID CATABOLISM PURIFICATION DNA SEQUENCING SEQUENCE COMPARISION PROTEIN SEQUENCING Epimastigotes de Trypanosoma cruzi, el protozoo parásito que causa la enfermedad de Chagas, contienen dos glutamato dehidrogenasas diferentes (GluDHs), NAD y NADPdependientes. En este sentido los parásitos se asemejan a las bacterias, hongos y plantasy se diferencian de animales superiores que poseen sólo una enzima inespecífica paracoenzima. La GluDH-NADP dependiente (EC 1.4.1.4) es un hexámero formado porsubunidades idénticas de 47kDa, mostrando ser muy semejante a la correspondienteenzima de E. coli en cuanto a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal. Laforma NADP dependiente podría ser biosintética mientras la forma NAD dependientepodría tener un rol catabólico. La GluDH-NADP dependiente fue purificada a homogeneidad proteica a partir deepimastigotes de Trypanosoma cruzi mediante un protocolo mejorado que incluyecromatografía de afinidad en Blue Sepharose. Se determinó la secuencia de aminoácidosde 11 péptidos internos, obtenidos por digestión con BrCN, tripsina, endopeptidasa Arg-Co endopeptidasa Lys-C. Dichas secuencias, correspondientes aproximadamente al 30%de la molécula, mostraron una identidad del 74% con la enzima similar de E. coli. Utilizandoun suero policlonal monoespecífico producido contra la proteína purificada se realizó elrastreo de una biblioteca de expresión genómica de T. cruzi en el vector λgt11. De estaforma pudo seleccionarse un único clon conteniendo 270 pb correspondientes al extremo 3' del gen que fue secuenciado completamente. Reacciones de PCR usando iniciadoresconstruídos de acuerdo a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la enzimamadura y con la secuencia del clon correspondiente al extremo C-terminal pudieronclonarse y secuenciarse dos ORFs completos (TcGluDH1 y TcGluDH2). Las secuenciasobtenidas muestran mayor homología con la enzima de Escherichia coli (70-72% deidentidad), y menor homologia (52-57%)con la correspondiente enzima de eucariontesinferiores. A partir de la secuencia de ADN se predijo una proteína que contiene 446aminoácidos. Usando el gen TcGluDH1 como sonda se realizaron experimentos de Southern blot, usando fragmentos de restricción o cromosomas enteros separados porelectroforesis en campo pulsado, indicando variaciones entre los diferentes clones y cepasde parásitos, sugiriendo la presencia de varios genes codificando para la GluDH-NADP. Laexpresión de la enzima resultó ser diferente en los distintos estadíos del desarrollo. Laforma epimastigote presenta mayor cantidad de ARNm y proteína (a juzgar por la actividadenzimática y ensayos de Western blot), en comparación con otras formas del parásito. Elgen clonado TcGluDH1 fue expresado en E. coli, produciendo una enzima recombinanteactiva con constantes cinéticas similares a la enzima natural. A pesar de que las evidenciasbioquímicas sugieren que la enzima se localiza tanto en el citoplasma como en lamitocondria, nuestros resultados indican una localización exclusivamente citosólica parala GluDH-NADP. Epimastigotes of Trypanosoma cruzi, the parasitic protozoan which causes Chagasdisease, contain two different glutamate dehydrogenases (GluDHs), one NADP-linked andone NAD-linked. The parasite therefore resembles bacteria, fungi and plants in this respect,and clearly differs from higher animals, which possess only one, coenzyme-unspecific, GluDH. The NADP-GluDH (EC 1.4.1.4), which is an hexamer made up of identical subunitsof Mr 47.000, seems to be very similar to the enzyme from E. coli in terms of amino acidcomposition and N-terminal sequence. The HADP-GluDH might be biosynthetic, whereasthe NAD-linked enzyme might have a catabolic role. The NADP-linked glutamate dehydrogenase has been purified to homogeneity fromepimastigotes of Trypanosoma cruzi by an improved procedure using Blue Sepharoseaffinity chromatography. The amino acid sequences of 11 internal peptides obtained bydigestion with CHBr, trypsin, Arg-C endopeptidase or LysC endopeptidase, showed 74%identity with the similar enzyme from E. coli, over about 30% of the molecule. Apolyclonalmonoespecific antiserum against the purified enzyme was used for screening a genomicexpression library of T.cruzi in λgt11. A clone containing 270 bps at the 3'-end of the genewas selected, and completely sequenced. Using PCR reactions with oligonucleotide primerssynthesized according to the amino acid sequence of the N-terminus of the mature enzyme,and to the nucleotide sequence of a clone corresponding to the C-terminus, two complete ORFs (TcGluDH1 and TcGluDH2) were isolated and sequenced. The sequences obtainedare most similar to that of the NADP-GluDH of Escherichia coli (70-72% identity), andless similar (52-57%) to those of lower eukaryotes. The protein predicted from DNAsequence contains 446 amino acids residues. Using TcGluDH1 as a probe, Southern blotexperiments of both, restriction fragments and whole chromosomes separated by pulsed-fieldelectrophoresis,indicated variations among different parasite strains and clones, andevidence for the presence of several genes. The expression of the enzyme was shown tobe developmentally regulated, the epimastigote stage having a considerably larger amountof both, mRNA and protein (as judged from enzyme activity and Western blots), ascompared with the other parasite forms. The cloned gene TcGluDH1 was expressed in E.coli, producing active recombinant enzyme with kinetic constants similar to those of thenatural NADP-GluDH. Although biochemical evidence had previously suggested that theenzyme has a multiple localization (cytosolic and mitochondrial localization), our resultssuggested an exclusively cytosolic localization for NADP-GluDH. Fil: Barderi, Patricia Alejandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1998 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3065_Barderi

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