Caracterización del mecanismo de glicosilación de proteínas en protozoarios

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La glicosilación de residuos de asparagina en las proteínas ocurre por elmismo mecanismo en todos los eucariotes estudiados, excepto en protozoarios de la familia Trypanosomatidae. Este consiste en la transferencia cotraduccional del oligosacárido Glc3Man9GlcNAc2 a partir del derivado de dolicol-P-P...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	De la Canal, Laura
Otros Autores:	Parodi, Armando J.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1987
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2061_DelaCanal
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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Además, en algunos de ellos el oligosacárido transferido resultó tenermenos de nueve restos de manosa, pero en esos casos su estructura es la misma que la del oligosacárido del mismo tamaño intermediario en el ciclo del dolicol en mamíferos. Los derivados de dolicol-P-P que se acumulan y transfieren a proteínas son: Man9GlcNAc2 en epimastigotes de Trypanosoma cruzi y en Trypanosoma conorhini, Trypanosoma dionisii, Leptomonas samueli, Herpetomonas samuelpessoai y Herpetomonas muscarum; Man6GlcNAc2 en Leishmania mexicana, Leishmania adleri y Blastocrithidia culicis, y finalmente, Man7GlcNAc2 en Crithidia fascicuiata, Crithidia harmosa y amastigotes de cultivo axénico de T. cruzi. Aquí se han estudiado diversos aspectos del mecanismo de N-glicosilaciónde proteínas en tripanosomátidos con el objeto de determinar el origen de sus peculiaridades. Los principales resultados y conclusiones obtenidas se resumen a continuación. 1. La característica de transferir a proteínas oligosacáridos no glucosilados no es común a todos los protozoarios. Se demostró que el protozoario de vida libre Euglena gracilis transfiere Glc3Man9GlcNAc2 al igual que el resto de los eucariotes previamente estudiados. 2. Contrariamente a lo que se presuponía, miembros de un mismo género de tripanosomátidos pueden acumular derivados de Dol-P-P con oligosacáridos de diferente tamaño. Aquí se presentan evidencias de que células de Leishmania enriettii acumulan Man7GlcNAc2 mientras que previamente se había determinado la síntesis de Man6GlcNAc2-P-P-dolicol en otras dos especies de Leishmania. 3. Preparaciones de membrana de T. cruzi, L. enriettii, C. fasciculata y B. culicis sintetizan dolicol-P-Man pero no dolicol-P-Glc, que es el dador de restos glucosilo en el ensamblaje de lípido-oligosacáridos en otros eucariotes. Se concluye que la deficiencia primaria que conduce a estos tripanosomátidos a formar derivados de dolicol-P-P no glucosilados es la ausencia de actividad de UDP-Glc:dolicol-P-glucosiltransferasa, y por lo tanto su incapacidad de sintetizar dolicol-P-Glc. 4. Se diseñó un ensayo para la medición de actividades de manosiltransferasa dolicol-P-Man dependientes que consiste en la incubación de preparaciones de membrana con dolicol-P, GDP(14C)Man y aceptores exógenos (Man5-8GlcNAc2-P-P-dolicol). Luego por extracción de los derivados de dolicol-P-P sintetizados y análisis de los oligosacáridos radioactivos se puede determinar la presencia o ausencia de ciertas actividades de manosiltransferasa. 5. Utilizando el método que acaba de describirse se pudo determinar que B.culicis, que "in vivo" forma Man6GlcNAc2, "in vitro" es incapaz de transferir el séptimo, octavo y noveno residuo de manosa al lípido-oligosacárido preformado. L. enriettii y C. fasciculata que transfieren Man7GlcNAc2 "in vivo", noproducen la adición del octavo y noveno resto de manosa "in vitro". Seconcluye que: a) existen al menos tres actividades diferentes dedolicol-P-Man:dolicol-P-P-oligosacárido manosiltransferasa, y b) la síntesis de derivados de dolicol-P-P truncados en estos tripanosomátidos se debería a un bloqueo en la adición de determinados restos de manosa, originado por la falta de actividad de ciertas manosiltransferasas dolicol-P-Man dependientes. 6. Se determinó que en C. fasciculata los dadores de restos de manosa en el ensamblaje del dolicol-P-P-oligosacárido son los mismos que en células de mamífero: GDP-Man actúa como dador de los primeros cinco restos de manosa y dolicol-P-Man de los restantes. 7. Por primera vez se estudiaron los oligosacáridos unidos a dolicol-P-P yaquellos presentes en glicoproteínas de alta manosa en las formas tripomastigote (infectiva) y amastigotes intracelulares de T. cruzi. Se determinó que estos últimos transfieren a proteínas Man9GlcNAc2 mientras que la forma infectiva transfiere Man9GlcNA2 y Man7GlcNAc2. En la Fig. 45 se presenta el mecanismo de N-glicosilación de proteínas propuesto para estas dos formas del parásito. 8. En cuanto a las formas epimastigote y amastigotes axénicos de T. cruzi se había determinado que células de clones CA-I transferían a proteínas Man9GlcNAc2 y Man9GlcNAc2 más Man7GlcNAc2, respectivamente. Aquí se presentan evidencias de que las mismas formas de un clon no relacionado (M 80/88) acumulan como derivados de dolicol-P-P los mismos oligosacáridos que habían sido descriptos para clones CA-I. 9. De los puntos 7 y 8 se desprende que durante la diferenciación de T. cruci se produce un cambio en el mecanismo de N-glicosilación que conduce a la transferencia a proteínas de oligosacáridos de diferente tamaño. T. cruzi es el primer eucariote donde se demuestra una modificación en el tamaño del oligosacárido transferido durante la diferenciación. 10. Se estudió el orden de remoción de los primeros restos de manosa durante el procesamiento de glicoproteínas en epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi. En ambas formas el procesamiento comienza con la remoción de losmismos residuos pero en los tripomastigotes se obtienen finalmente oligosacáridos más procesados. 11. En epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi se investigó la presencia de oligosacáridos tipo complejo en glicoproteínas. La detección de restos de galactosa en el material resistente a la enzima endo-β-N-acetilglucosaminidasa H y a la β-eliminación indica que existen oligosacáridos complejos en ambas formas del parásito. Los resultados obtenidos aportan nuevos conocimientos acerca del mecanismode N-glicosilación de proteínas en tripanosomátidos y permitencomprender varias de las peculiaridades que este presenta. Al mismo tiempo se han formulado especulaciones evolutivas que permitirían explicar la síntesis de derivados de dolicol-P-P truncados en ciertos tripanosomátidos.
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Además, en algunos de ellos el oligosacárido transferido resultó tenermenos de nueve restos de manosa, pero en esos casos su estructura es la misma que la del oligosacárido del mismo tamaño intermediario en el ciclo del dolicol en mamíferos. Los derivados de dolicol-P-P que se acumulan y transfieren a proteínas son: Man9GlcNAc2 en epimastigotes de Trypanosoma cruzi y en Trypanosoma conorhini, Trypanosoma dionisii, Leptomonas samueli, Herpetomonas samuelpessoai y Herpetomonas muscarum; Man6GlcNAc2 en Leishmania mexicana, Leishmania adleri y Blastocrithidia culicis, y finalmente, Man7GlcNAc2 en Crithidia fascicuiata, Crithidia harmosa y amastigotes de cultivo axénico de T. cruzi. Aquí se han estudiado diversos aspectos del mecanismo de N-glicosilaciónde proteínas en tripanosomátidos con el objeto de determinar el origen de sus peculiaridades. Los principales resultados y conclusiones obtenidas se resumen a continuación. 1. La característica de transferir a proteínas oligosacáridos no glucosilados no es común a todos los protozoarios. Se demostró que el protozoario de vida libre Euglena gracilis transfiere Glc3Man9GlcNAc2 al igual que el resto de los eucariotes previamente estudiados. 2. Contrariamente a lo que se presuponía, miembros de un mismo género de tripanosomátidos pueden acumular derivados de Dol-P-P con oligosacáridos de diferente tamaño. Aquí se presentan evidencias de que células de Leishmania enriettii acumulan Man7GlcNAc2 mientras que previamente se había determinado la síntesis de Man6GlcNAc2-P-P-dolicol en otras dos especies de Leishmania. 3. Preparaciones de membrana de T. cruzi, L. enriettii, C. fasciculata y B. culicis sintetizan dolicol-P-Man pero no dolicol-P-Glc, que es el dador de restos glucosilo en el ensamblaje de lípido-oligosacáridos en otros eucariotes. Se concluye que la deficiencia primaria que conduce a estos tripanosomátidos a formar derivados de dolicol-P-P no glucosilados es la ausencia de actividad de UDP-Glc:dolicol-P-glucosiltransferasa, y por lo tanto su incapacidad de sintetizar dolicol-P-Glc. 4. Se diseñó un ensayo para la medición de actividades de manosiltransferasa dolicol-P-Man dependientes que consiste en la incubación de preparaciones de membrana con dolicol-P, GDP(14C)Man y aceptores exógenos (Man5-8GlcNAc2-P-P-dolicol). Luego por extracción de los derivados de dolicol-P-P sintetizados y análisis de los oligosacáridos radioactivos se puede determinar la presencia o ausencia de ciertas actividades de manosiltransferasa. 5. Utilizando el método que acaba de describirse se pudo determinar que B.culicis, que "in vivo" forma Man6GlcNAc2, "in vitro" es incapaz de transferir el séptimo, octavo y noveno residuo de manosa al lípido-oligosacárido preformado. L. enriettii y C. fasciculata que transfieren Man7GlcNAc2 "in vivo", noproducen la adición del octavo y noveno resto de manosa "in vitro". Seconcluye que: a) existen al menos tres actividades diferentes dedolicol-P-Man:dolicol-P-P-oligosacárido manosiltransferasa, y b) la síntesis de derivados de dolicol-P-P truncados en estos tripanosomátidos se debería a un bloqueo en la adición de determinados restos de manosa, originado por la falta de actividad de ciertas manosiltransferasas dolicol-P-Man dependientes. 6. Se determinó que en C. fasciculata los dadores de restos de manosa en el ensamblaje del dolicol-P-P-oligosacárido son los mismos que en células de mamífero: GDP-Man actúa como dador de los primeros cinco restos de manosa y dolicol-P-Man de los restantes. 7. Por primera vez se estudiaron los oligosacáridos unidos a dolicol-P-P yaquellos presentes en glicoproteínas de alta manosa en las formas tripomastigote (infectiva) y amastigotes intracelulares de T. cruzi. Se determinó que estos últimos transfieren a proteínas Man9GlcNAc2 mientras que la forma infectiva transfiere Man9GlcNA2 y Man7GlcNAc2. En la Fig. 45 se presenta el mecanismo de N-glicosilación de proteínas propuesto para estas dos formas del parásito. 8. En cuanto a las formas epimastigote y amastigotes axénicos de T. cruzi se había determinado que células de clones CA-I transferían a proteínas Man9GlcNAc2 y Man9GlcNAc2 más Man7GlcNAc2, respectivamente. Aquí se presentan evidencias de que las mismas formas de un clon no relacionado (M 80/88) acumulan como derivados de dolicol-P-P los mismos oligosacáridos que habían sido descriptos para clones CA-I. 9. De los puntos 7 y 8 se desprende que durante la diferenciación de T. cruci se produce un cambio en el mecanismo de N-glicosilación que conduce a la transferencia a proteínas de oligosacáridos de diferente tamaño. T. cruzi es el primer eucariote donde se demuestra una modificación en el tamaño del oligosacárido transferido durante la diferenciación. 10. Se estudió el orden de remoción de los primeros restos de manosa durante el procesamiento de glicoproteínas en epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi. En ambas formas el procesamiento comienza con la remoción de losmismos residuos pero en los tripomastigotes se obtienen finalmente oligosacáridos más procesados. 11. En epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi se investigó la presencia de oligosacáridos tipo complejo en glicoproteínas. La detección de restos de galactosa en el material resistente a la enzima endo-β-N-acetilglucosaminidasa H y a la β-eliminación indica que existen oligosacáridos complejos en ambas formas del parásito. Los resultados obtenidos aportan nuevos conocimientos acerca del mecanismode N-glicosilación de proteínas en tripanosomátidos y permitencomprender varias de las peculiaridades que este presenta. Al mismo tiempo se han formulado especulaciones evolutivas que permitirían explicar la síntesis de derivados de dolicol-P-P truncados en ciertos tripanosomátidos. Fil: De la Canal, Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1987 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2061_DelaCanal

Caracterización del mecanismo de glicosilación de proteínas en protozoarios

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