Efecto de una metaloproteinasa de veneno de serpiente del nordeste argentino sobre la agregación plaquetaria
Los venenos de serpientes son una mezcla de proteínas y péptidos biológicamente activos, que actúan afectando la hemostasia por activación o inhibición de factores de la coagulación y de receptores plaquetarios, o bien por daño del endotelio mediante clivaje de componentes de la membrana basal. La...
| Autor principal: | |
|---|---|
| Formato: | Reunión |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica
2023
|
| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/52486 |
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Español |
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Baltergina Plaquetas Bothrops alternatus Ristocetina Colágeno Luque, Daiana Evelyn Efecto de una metaloproteinasa de veneno de serpiente del nordeste argentino sobre la agregación plaquetaria |
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Los venenos de serpientes son una mezcla de proteínas y péptidos biológicamente activos, que actúan afectando la hemostasia por
activación o inhibición de factores de la coagulación y de receptores plaquetarios, o bien por daño del endotelio mediante clivaje de
componentes de la membrana basal. Las Metaloproteinasas de Venenos de Serpientes (SVMPs) constituyen la familia de proteínas
más abundantes del veneno de Bothrops alternatus (yarará grande). Baltergina es una PIII SVMP, aislada de este veneno, con
actividades proteolítica, hemorrágica, procoagulante y desintegrina, capaz de unirse y bloquear integrinas de membrana. Luego de
una injuria, la interacción del complejo plaquetario GPIb-IX-V con el factor de von Willebrand (FvW), y de la integrina a2b1 con el
colágeno tipo I expuesto en la membrana basal, juegan un rol clave en la activación y agregación plaquetaria, convirtiéndose en
blancos de acción de las SVMPs. El objetivo de este trabajo fue utilizar un método turbidimétrico, empleando lectora de microplacas,
para evaluar el efecto de baltergina sobre la agregación plaquetaria. La enzima se purificó a partir del veneno de especímenes
adultos de B. alternatus por combinación de dos técnicas cromatográficas. Para obtener baltergina inactivada, se incubó con
Na2EDTA (inhibidor), y el excedente de éste se eliminó por cromatografía de exclusión molecular. Se ensayó la actividad proteolítica,
para comprobar la efectividad del inhibidor, y se realizó la cuantificación de proteínas. Primeramente, se determinó la actividad
procoagulante de la enzima utilizando plasma citratado incubado con baltergina (0,007; 0,07; 0,35 y 0,7 μM) y se registraron los
tiempos de coagulación (TC) utilizando un coagulómetro. Se obtuvo el Plasma Rico en Plaquetas (PRP) a partir de muestras de
sangre citratada, centrifugando a bajas revoluciones y tomando los dos tercios inferiores. La fracción superior restante se centrifugó
a altas revoluciones, y del sobrenadante se obtuvo Plasma Pobre en Plaquetas (PPP). El PRP se incubó a 37°C con diferentes
concentraciones de baltergina (0,007–0,07 μM) y baltergina-Na2EDTA (0,07 μM) durante 20 minutos para ristocetina (1,5 μg/ml) y 5
minutos para colágeno tipo I (5 μg/ml). Se registró la turbidez de la suspensión a 405 nm por 5 minutos a 37°C, con agitación
constante, utilizando lectora de microplacas y se calculó el porcentaje de agregación plaquetaria. Por último, se realizó el análisis
estadístico de los datos mediante ANOVA siguiendo el test de Tukey con valores de p < 0,05. Se determinó la concentración máxima
de baltergina a la cual el plasma no coagula y se decidió trabajar con concentraciones menores o igual a 0,07 μM. Mediante el
ensayo de agregación en lectora de microplacas, se demostró que la enzima, en una concentración de 0,07 μM, fue capaz de inhibir
significativamente la agregación inducida por colágeno, obteniéndose valores de 30,67 ±2,13% y 57,49 ±0,50%, en presencia y
ausencia de baltergina, respectivamente. El colágeno se une al receptor a2b1 presente en la superficie plaquetaria desencadenando
el proceso de agregación. Baltergina podría unirse al dominio a2I del receptor evitando la unión del colágeno, como se demostró
para otras SVMPs, a través del su dominio símil desintegrina. Se comprobó además que baltergina (0,07 μM) inhibió
significativamente la agregación plaquetaria mediada por ristocetina, obteniéndose valores de 56,59 ±1,25% y 77,05 ±0,16% en
presencia y ausencia de la enzima, respectivamente. Este ensayo evalúa la unión del FvW al receptor GPIb-IX-V. Sin embargo,
baltergina-Na2EDTA no modificó la agregación plaquetaria mediada por este agonista (78,48 ±1,84%). En este caso, la actividad
inhibidora podría deberse a la acción proteolítica de la enzima sobre el FvW o sobre su receptor, demostrando que el dominio
catalítico de baltergina es fundamental en el efecto inhibitorio. En conclusión, se pudo demostrar que baltergina (0,07 μM) fue capaz
de inhibir la agregación plaquetaria mediada por colágeno y ristocetina. Asimismo, en la agregación mediada por ristocetina se
comprobó que el dominio catalítico de la enzima es el responsable de su acción inhibitoria. Estudios posteriores, utilizando factores
y/o receptores plaquetarios podrán dilucidar el mecanismo molecular de acción de la metaloproteinasa y evaluar su potencial uso
como agente antitrombótico. |
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Luque, Daiana Evelyn |
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I48-R184-123456789-524862025-03-06T11:14:53Z Efecto de una metaloproteinasa de veneno de serpiente del nordeste argentino sobre la agregación plaquetaria Luque, Daiana Evelyn Baltergina Plaquetas Bothrops alternatus Ristocetina Colágeno Los venenos de serpientes son una mezcla de proteínas y péptidos biológicamente activos, que actúan afectando la hemostasia por activación o inhibición de factores de la coagulación y de receptores plaquetarios, o bien por daño del endotelio mediante clivaje de componentes de la membrana basal. Las Metaloproteinasas de Venenos de Serpientes (SVMPs) constituyen la familia de proteínas más abundantes del veneno de Bothrops alternatus (yarará grande). Baltergina es una PIII SVMP, aislada de este veneno, con actividades proteolítica, hemorrágica, procoagulante y desintegrina, capaz de unirse y bloquear integrinas de membrana. Luego de una injuria, la interacción del complejo plaquetario GPIb-IX-V con el factor de von Willebrand (FvW), y de la integrina a2b1 con el colágeno tipo I expuesto en la membrana basal, juegan un rol clave en la activación y agregación plaquetaria, convirtiéndose en blancos de acción de las SVMPs. El objetivo de este trabajo fue utilizar un método turbidimétrico, empleando lectora de microplacas, para evaluar el efecto de baltergina sobre la agregación plaquetaria. La enzima se purificó a partir del veneno de especímenes adultos de B. alternatus por combinación de dos técnicas cromatográficas. Para obtener baltergina inactivada, se incubó con Na2EDTA (inhibidor), y el excedente de éste se eliminó por cromatografía de exclusión molecular. Se ensayó la actividad proteolítica, para comprobar la efectividad del inhibidor, y se realizó la cuantificación de proteínas. Primeramente, se determinó la actividad procoagulante de la enzima utilizando plasma citratado incubado con baltergina (0,007; 0,07; 0,35 y 0,7 μM) y se registraron los tiempos de coagulación (TC) utilizando un coagulómetro. Se obtuvo el Plasma Rico en Plaquetas (PRP) a partir de muestras de sangre citratada, centrifugando a bajas revoluciones y tomando los dos tercios inferiores. La fracción superior restante se centrifugó a altas revoluciones, y del sobrenadante se obtuvo Plasma Pobre en Plaquetas (PPP). El PRP se incubó a 37°C con diferentes concentraciones de baltergina (0,007–0,07 μM) y baltergina-Na2EDTA (0,07 μM) durante 20 minutos para ristocetina (1,5 μg/ml) y 5 minutos para colágeno tipo I (5 μg/ml). Se registró la turbidez de la suspensión a 405 nm por 5 minutos a 37°C, con agitación constante, utilizando lectora de microplacas y se calculó el porcentaje de agregación plaquetaria. Por último, se realizó el análisis estadístico de los datos mediante ANOVA siguiendo el test de Tukey con valores de p < 0,05. Se determinó la concentración máxima de baltergina a la cual el plasma no coagula y se decidió trabajar con concentraciones menores o igual a 0,07 μM. Mediante el ensayo de agregación en lectora de microplacas, se demostró que la enzima, en una concentración de 0,07 μM, fue capaz de inhibir significativamente la agregación inducida por colágeno, obteniéndose valores de 30,67 ±2,13% y 57,49 ±0,50%, en presencia y ausencia de baltergina, respectivamente. El colágeno se une al receptor a2b1 presente en la superficie plaquetaria desencadenando el proceso de agregación. Baltergina podría unirse al dominio a2I del receptor evitando la unión del colágeno, como se demostró para otras SVMPs, a través del su dominio símil desintegrina. Se comprobó además que baltergina (0,07 μM) inhibió significativamente la agregación plaquetaria mediada por ristocetina, obteniéndose valores de 56,59 ±1,25% y 77,05 ±0,16% en presencia y ausencia de la enzima, respectivamente. Este ensayo evalúa la unión del FvW al receptor GPIb-IX-V. Sin embargo, baltergina-Na2EDTA no modificó la agregación plaquetaria mediada por este agonista (78,48 ±1,84%). En este caso, la actividad inhibidora podría deberse a la acción proteolítica de la enzima sobre el FvW o sobre su receptor, demostrando que el dominio catalítico de baltergina es fundamental en el efecto inhibitorio. En conclusión, se pudo demostrar que baltergina (0,07 μM) fue capaz de inhibir la agregación plaquetaria mediada por colágeno y ristocetina. Asimismo, en la agregación mediada por ristocetina se comprobó que el dominio catalítico de la enzima es el responsable de su acción inhibitoria. Estudios posteriores, utilizando factores y/o receptores plaquetarios podrán dilucidar el mecanismo molecular de acción de la metaloproteinasa y evaluar su potencial uso como agente antitrombótico. 2023-09-18T11:39:38Z 2023-09-18T11:39:38Z 2019 Reunión Luque, Daiana Evelyn, 2019. Efecto de una metaloproteinasa de veneno de serpiente del nordeste argentino sobre la agregación plaquetaria. En: XXV Comunicaciones Científicas y Tecnológicas Edición 2019. Corrientes: Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica, p. 1-1. http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/52486 spa UNNE/PI/17F003/AR. Corrientes/Efecto de toxinas de venenos de serpientes del nordeste argentino en la función plaquetaria. openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ application/pdf p. 1-1 application/pdf Universidad Nacional del Nordeste. Secretaría General de Ciencia y Técnica |