Mecanismos involucrados en la resistencia celular a la acción de eritropoyetina
La eritropoyetina (Epo) es una glicoproteína perteneciente a la familia de las citoquinas producida por los riñones en el individuo adulto. Su principal acción es inducir proliferación, supervivencia y diferenciación de los progenitores eritroides. La anemia, uno de los signos que más contribuye al...
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| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2020
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ERITROPOYETINA HOMOCISTEINA ADENOSINA HOMOCISTEINA TIOLACTONA N-HOMOCISTEINILACION APOPTOSIS CELULAS ERITROLEUCEMICAS RESISTENCIA A LA ERITROPOYETINA ERYTHROPOIETIN HOMOCYSTEINE ADENOSINE HOMOCYSTEINE THIOLACTONE N-HOMOCYSTEINYLATION APOPTOSIS ERYTHROLEUKEMIA CELLS RESISTANCE TO ERYTHROPOIETIN |
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La eritropoyetina (Epo) es una glicoproteína perteneciente a la familia de las citoquinas producida por los riñones en el individuo adulto. Su principal acción es inducir proliferación, supervivencia y diferenciación de los progenitores eritroides. La anemia, uno de los signos que más contribuye al deterioro de la calidad de vida de los pacientes con insuficiencia renal, es principalmente atribuida a la disminución del aporte de Epo debido a la reducción de la masa funcional del riñón. La purificación y clonación de esta citoquina permitió la generación de eritropoyetina recombinante (rHuEpo) usándose, en un principio, para contrarrestar la anemia de la enfermedad renal crónica, dado que el tratamiento permitía disminuir la frecuencia de transfusiones, reducir la mortalidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Luego se expandió el uso de la rHuEpo al tratamiento de la anemia asociada a distintas patologías crónicas. A partir del hallazgo de la expresión del receptor de Epo (EpoR) en tejidos no hematopoyéticos y la habilidad protectora de rHuEpo frente a respuestas inflamatorias o estímulos apoptóticos se amplió la posibilidad de su espectro terapéutico. Sin embargo, esta acción no eritropoyética necesita dosis más elevadas que las utilizadas para el tratamiento de la anemia. Diversos ensayos han vinculado el uso de altas dosis de Epo con distintos efectos negativos, como estados protrombóticos o problemas cardíacos. A pesar del éxito del uso de la rHuEpo y sus derivados en diversas patologías, un porcentaje de pacientes no responde al tratamiento. Las dosis de la hormona requeridas para un tratamiento efectivo, así como la sensibilidad de los pacientes a la droga, varían ampliamente. No sólo se han descripto efectos negativos debido a las dosis elevadas, sino también resistencia al tratamiento con la hormona en pacientes que reciben dosis elevadas de rHuEpo pero no pueden alcanzar los niveles adecuados de hemoglobinemia. Teniendo esto en cuenta, el objetivo de esta Tesis Doctoral es ampliar el conocimiento acerca de mecanismos que pueden estar involucrados en la inhibición de los efectos biológicos de Epo. Durante el desarrollo del plan de trabajo se utilizaron líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide en ensayos realizados para investigar el efecto de altas concentraciones de Epo sobre la funcionalidad de la citoquina. Por otro lado, se evaluó la acción de Epo en condiciones inflamatorias o en presencia de posibles “toxinas” que suelen acumularse en la insuficiencia renal crónica y/o en enfermedad cardiovascular. Resultados previos del laboratorio mostraron que la Epo protege a células K562 diferenciadas al linaje eritroide de la apoptosis inducida por la citoquina proinflamatoria TNF- α. En este trabajo se observó que este efecto protector de Epo desaparece al aumentar su concentración. La falta de cambios en la expresión del EpoR nos llevó a estudiar mecanismos involucrados con el cierre de la señal. Se sabe que la unión de Epo a su receptor ocasiona la internalización del mismo, la cual es mediada por el proteasoma. El uso del inhibidor de proteasoma MG132, permitió recuperar la actividad antiapoptótica de la Epo, sugiriendo que el uso de altas concentraciones de Epo afectaría la internalización del EpoR, llevando a la pérdida de función observada. En los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal se detecta un aumento del aminoácido no esencial homocisteína (Hcy) en sangre (hiperhomocisteinemia, HHcy). Además, se ha reportado que la HHcy puede originar un aumento intracelular de la concentración de S-adenosilhomocisteína (SAH), potente inhibidor competitivo de la mayoría de las enzimas metiltransferasas. En estadios crónicos, esta patología se asocia también a procesos inflamatorios. La acumulación de Hcy y adenosina (Ado) produce un desfasaje del ciclo de la metionina que lleva a la hipometilación de ADN. La importancia biológica de los niveles aumentados de SAH se registra principalmente en su rol en la regulación génica y en la transducción de señales. Para evaluar el efecto debido a la presencia de los dos compuestos y su relación con la función de Epo, células K562, en distintos estadios de diferenciación eritroide, fueron incubadas con Hcy y Ado, agregando a los cultivos TNF- α para simular condiciones inflamatorias. La presencia de Hcy-Ado aumentó la apoptosis celular, incrementando la actividad de caspasa 3, e indujo resistencia a la acción antiapoptótica de Epo frente al TNF- α. Se demostró que la despolarización de la membrana mitocondrial, provocada por la presencia de Hcy-Ado-TNF-α, está involucrada en el mecanismo de resistencia observada en estos tratamientos. La homocisteína tiolactona (HTL) es un derivado reactivo de la Hcy y puede unirse de forma covalente a los grupos ε-amino de los residuos lisina de las proteínas, en una reacción llamada N-homocisteinilación. Aquí, se demostró que la Epo puede ser N-homocisteinilada (HTLEpo). Se observó disminución de la proliferación y aumento de la apoptosis de las células UT-7, dependientes de Epo, al ser tratadas con la hormona previamente incubada con HTL. Mediante diversos estudios estructurales se demostró que la molécula de Epo sufre modificaciones por N-homocisteinilación. La Epo N-homocisteinilada muestra un aumento en las estructuras de hoja- β en detrimento de α-hélice. Este aumento de hojas- β repetitivas se relaciona con la formación de oligómeros, con menor movilidad electroforética. El aumento del radio de la proteína N-homocistenilada, determinado por la técnica de dispersión de luz dinámica, apoya la hipótesis de la formación de oligómeros solubles. Estos cambios estructurales en la molécula perturbarían la adaptación espacial requerida para una interacción ligando-receptor eficiente y, por lo tanto, se produciría la alteración de las funciones proliferativa y antiapoptóticas de Epo. Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral intentan ampliar los conocimientos referentes a posibles mecanismos involucrados en la resistencia al tratamiento con Epo en varias patologías. En modelos celulares, observamos en presencia de altas concentraciones de Epo, una alteración de su funcionalidad, relacionada con un aumento de la velocidad de silenciamiento del receptor, vinculamos un posible efecto entre el aumento de la concentración de Hcy y Ado con la resistencia a la activación celular por Epo y describimos por primera vez la modificación estructural ocasionada por N-homocisteinilación de la Epo que conduce a alteraciones funcionales. |
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Vittori, Daniela Cecilia Schiappacasse, Agustina |
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I28-R145-tesis_n6966_Schiappacasse_oai2023-04-26 Vittori, Daniela Cecilia Schiappacasse, Agustina 2020-03-12 La eritropoyetina (Epo) es una glicoproteína perteneciente a la familia de las citoquinas producida por los riñones en el individuo adulto. Su principal acción es inducir proliferación, supervivencia y diferenciación de los progenitores eritroides. La anemia, uno de los signos que más contribuye al deterioro de la calidad de vida de los pacientes con insuficiencia renal, es principalmente atribuida a la disminución del aporte de Epo debido a la reducción de la masa funcional del riñón. La purificación y clonación de esta citoquina permitió la generación de eritropoyetina recombinante (rHuEpo) usándose, en un principio, para contrarrestar la anemia de la enfermedad renal crónica, dado que el tratamiento permitía disminuir la frecuencia de transfusiones, reducir la mortalidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Luego se expandió el uso de la rHuEpo al tratamiento de la anemia asociada a distintas patologías crónicas. A partir del hallazgo de la expresión del receptor de Epo (EpoR) en tejidos no hematopoyéticos y la habilidad protectora de rHuEpo frente a respuestas inflamatorias o estímulos apoptóticos se amplió la posibilidad de su espectro terapéutico. Sin embargo, esta acción no eritropoyética necesita dosis más elevadas que las utilizadas para el tratamiento de la anemia. Diversos ensayos han vinculado el uso de altas dosis de Epo con distintos efectos negativos, como estados protrombóticos o problemas cardíacos. A pesar del éxito del uso de la rHuEpo y sus derivados en diversas patologías, un porcentaje de pacientes no responde al tratamiento. Las dosis de la hormona requeridas para un tratamiento efectivo, así como la sensibilidad de los pacientes a la droga, varían ampliamente. No sólo se han descripto efectos negativos debido a las dosis elevadas, sino también resistencia al tratamiento con la hormona en pacientes que reciben dosis elevadas de rHuEpo pero no pueden alcanzar los niveles adecuados de hemoglobinemia. Teniendo esto en cuenta, el objetivo de esta Tesis Doctoral es ampliar el conocimiento acerca de mecanismos que pueden estar involucrados en la inhibición de los efectos biológicos de Epo. Durante el desarrollo del plan de trabajo se utilizaron líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide en ensayos realizados para investigar el efecto de altas concentraciones de Epo sobre la funcionalidad de la citoquina. Por otro lado, se evaluó la acción de Epo en condiciones inflamatorias o en presencia de posibles “toxinas” que suelen acumularse en la insuficiencia renal crónica y/o en enfermedad cardiovascular. Resultados previos del laboratorio mostraron que la Epo protege a células K562 diferenciadas al linaje eritroide de la apoptosis inducida por la citoquina proinflamatoria TNF- α. En este trabajo se observó que este efecto protector de Epo desaparece al aumentar su concentración. La falta de cambios en la expresión del EpoR nos llevó a estudiar mecanismos involucrados con el cierre de la señal. Se sabe que la unión de Epo a su receptor ocasiona la internalización del mismo, la cual es mediada por el proteasoma. El uso del inhibidor de proteasoma MG132, permitió recuperar la actividad antiapoptótica de la Epo, sugiriendo que el uso de altas concentraciones de Epo afectaría la internalización del EpoR, llevando a la pérdida de función observada. En los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal se detecta un aumento del aminoácido no esencial homocisteína (Hcy) en sangre (hiperhomocisteinemia, HHcy). Además, se ha reportado que la HHcy puede originar un aumento intracelular de la concentración de S-adenosilhomocisteína (SAH), potente inhibidor competitivo de la mayoría de las enzimas metiltransferasas. En estadios crónicos, esta patología se asocia también a procesos inflamatorios. La acumulación de Hcy y adenosina (Ado) produce un desfasaje del ciclo de la metionina que lleva a la hipometilación de ADN. La importancia biológica de los niveles aumentados de SAH se registra principalmente en su rol en la regulación génica y en la transducción de señales. Para evaluar el efecto debido a la presencia de los dos compuestos y su relación con la función de Epo, células K562, en distintos estadios de diferenciación eritroide, fueron incubadas con Hcy y Ado, agregando a los cultivos TNF- α para simular condiciones inflamatorias. La presencia de Hcy-Ado aumentó la apoptosis celular, incrementando la actividad de caspasa 3, e indujo resistencia a la acción antiapoptótica de Epo frente al TNF- α. Se demostró que la despolarización de la membrana mitocondrial, provocada por la presencia de Hcy-Ado-TNF-α, está involucrada en el mecanismo de resistencia observada en estos tratamientos. La homocisteína tiolactona (HTL) es un derivado reactivo de la Hcy y puede unirse de forma covalente a los grupos ε-amino de los residuos lisina de las proteínas, en una reacción llamada N-homocisteinilación. Aquí, se demostró que la Epo puede ser N-homocisteinilada (HTLEpo). Se observó disminución de la proliferación y aumento de la apoptosis de las células UT-7, dependientes de Epo, al ser tratadas con la hormona previamente incubada con HTL. Mediante diversos estudios estructurales se demostró que la molécula de Epo sufre modificaciones por N-homocisteinilación. La Epo N-homocisteinilada muestra un aumento en las estructuras de hoja- β en detrimento de α-hélice. Este aumento de hojas- β repetitivas se relaciona con la formación de oligómeros, con menor movilidad electroforética. El aumento del radio de la proteína N-homocistenilada, determinado por la técnica de dispersión de luz dinámica, apoya la hipótesis de la formación de oligómeros solubles. Estos cambios estructurales en la molécula perturbarían la adaptación espacial requerida para una interacción ligando-receptor eficiente y, por lo tanto, se produciría la alteración de las funciones proliferativa y antiapoptóticas de Epo. Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral intentan ampliar los conocimientos referentes a posibles mecanismos involucrados en la resistencia al tratamiento con Epo en varias patologías. En modelos celulares, observamos en presencia de altas concentraciones de Epo, una alteración de su funcionalidad, relacionada con un aumento de la velocidad de silenciamiento del receptor, vinculamos un posible efecto entre el aumento de la concentración de Hcy y Ado con la resistencia a la activación celular por Epo y describimos por primera vez la modificación estructural ocasionada por N-homocisteinilación de la Epo que conduce a alteraciones funcionales. Erythropoietin (Epo) is a glycoprotein belonging to the cytokine family which is produced in adult kidneys. Its main actions are to induce proliferation, survival and differentiation of erythroid progenitors. Anemia, caused by low levels of Epo in the bloodstream due to a reduced functional renal mass, is one of the main conditions that affect the life quality of dialysis patients. Epo purification and cloning allowed the development of recombinant human erythropoietin (rHuEpo) which was used at first to overcome anemia of chronic renal disease and helped to improve the patients’ quality of life by reducing the frequency of transfusions and mortality rate. Later on, rHuEpo treatment was made extensive to anemia associated with other chronic pathologies. After expression of the erythropoietin receptor (EpoR) was found in non-hematopoietic tissues, along with the discovery of the protective ability of rHuEpo against inflammatory responses or apoptotic stimuli, the therapeutic spectrum of the cytokine was extended. However, this non-erythropoietic action requires much higher Epo doses than those used for the treatment of anemia. In this line, several clinical trials have linked the use of high doses of Epo with adverse effects such as prothrombotic states or heart disorders. Despite the successful use of rHuEpo and its derivatives in different pathologies, a percentage of patients fail to respond to treatment. The doses of the hormone required for effective treatment, as well as the patients’ sensitivity to Epo, are widely variable. Apart from reports of adverse effects, resistance to treatment has also been demonstrated in patients who receive high Epo doses but still cannot achieve adequate hemoglobin levels. Taking the above into account, the aim of this Doctoral Thesis is to increase the current knowledge about the mechanisms that would inhibit the biological effects of Epo. In order to achieve this, several cell lines capable of erythroid differentiation have been used to investigate the effect of high concentrations of Epo on its functions. On the other hand, the action of Epo has been evaluated in the presence of diverse compounds which tend to accumulate in chronic kidney disease, as well as under inflammatory conditions. Previous results from our group have shown that Epo protects differentiated K562 erythroid cells from the apoptotic effect of the proinflammatory cytokine TNF- α. In the present work, this protective action was not observed when high Epo concentrations were used. As no changes on EpoR expression were detected, the mechanisms involved in Epo signal downregulation were studied. It is known that the interaction of Epo with its receptor induces the proteasome-mediated internalization of the complex. The antiapoptotic effect of Epo was restored when the proteasome inhibitor MG132 was used. This suggests that high concentrations of Epo may affect EpoR internalization, causing the loss of Epo antiapoptotic effect. On the other hand, increased serum levels of the nonessential amino acid homocysteine (Hcy) have been detected in End-Stage Renal Disease patients. This condition, known as hyperhomocysteinemia (HHcy), may cause an increase in the intracellular concentration of S-adenosylhomocysteine (SAH), a potent inhibitor of transmethylation reactions. In chronic stages, it is associated with inflammatory processes. The accumulation of Hcy and adenosine (Ado) exerts a disruptive effect in the methionine cycle, leading to DNA hypomethylation. The biological importance of elevated levels of SAH is mainly related to the deregulation of gene expression and cell signaling. To evaluate the effect of Hcy and Ado on Epo function, differentiated and non-differentiated K562 cells were grown in the presence of both compounds, along with TNF-α, to mimic an inflammatory condition. Apoptosis and caspase 3 activity were increased leading to resistance to the protective effect of Epo against the action of TNF-α. Mitochondrial depolarization, observed when Hcy and Ado were present, could explain this resistance. Homocysteine thiolactone (HTL), a highly reactive Hcy derivative, reacts with the ε-amino groups of lysine residues in a reaction called protein N-homocysteinylation. In this work, it was shown for the first time that Epo can be N-homocysteinylated (HTLEpo). Decreased proliferation and increased apoptosis were observed in cultures of the Epo-dependent UT-7 cell line developed in the presence of HTLEpo. To elucidate whether this loss of Epo function could be due to molecular alteration, structural modifications of Epo treated with HTL were studied by different assays. The N-homocysteinylated Epo showed a secondary structure switch from α-helix to β-sheet. This enrichment in β-sheet structures was related to the formation of soluble oligomers with lower electrophoretic mobility. This hypothesis was further supported by an increase in the radius of the modified protein, as determined by Dynamic Light Scattering analysis. These structural changes might interfere with the conformational adaptations necessary for an efficient ligand-receptor interaction, thus affecting the proliferative and antiapoptotic functions of Epo. The results presented in this Doctoral Thesis are directed to increase the knowledge regarding different mechanisms possibly involved in the resistance to Epo treatment. In cell-based assays where high Epo concentrations were used, we demonstrated that the alteration of Epo effects could be related to an increased rate of EpoR inactivation. We also found an association between the accumulation of Hcy and Ado and the loss of biological activity of Epo, and for the first time we described structural modifications of the Epo molecule caused by N-homocysteinylation that lead to functional loss. Fil: Schiappacasse, Agustina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6966_Schiappacasse spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar ERITROPOYETINA HOMOCISTEINA ADENOSINA HOMOCISTEINA TIOLACTONA N-HOMOCISTEINILACION APOPTOSIS CELULAS ERITROLEUCEMICAS RESISTENCIA A LA ERITROPOYETINA ERYTHROPOIETIN HOMOCYSTEINE ADENOSINE HOMOCYSTEINE THIOLACTONE N-HOMOCYSTEINYLATION APOPTOSIS ERYTHROLEUKEMIA CELLS RESISTANCE TO ERYTHROPOIETIN Mecanismos involucrados en la resistencia celular a la acción de eritropoyetina Mechanisms involved in cellular resistance to the action of erythropoietin info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6966_Schiappacasse_oai |