Caracterización molecular y celular de la virulencia de un clon mayoritario de Leptospira interrogans en Argentina
Leptospira interrogans es el principal agente causal de la leptospirosis. La enfermedad constituye la zoonosis de mayor distribución mundial debido a que se contrae a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la vía principal de transmisión es el agua. La...
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2019
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6944_Nagel http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6944_Nagel_oai |
| Aporte de: |
| Sumario: | Leptospira interrogans es el principal agente causal de la leptospirosis. La enfermedad constituye la zoonosis de mayor distribución mundial debido a que se contrae a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la vía principal de transmisión es el agua. Las leptospiras patógenas se clasifican en serovares (sv) con diferente seroprevalencias de acuerdo al hospedador y la localización geográfica. A diferencia de lo que ocurre en otros países, en Argentina el serovar mayoritario en bovinos es Pomona. Esta serovariedad produce una infección severa siendo frecuente la mortalidad en terneros. Resultados previos de nuestro grupo, permitieron identificar al serovar Pomona y genotipos asociados, como mayoritarios entre aislamientos provenientes de bovinos, pero también de humanos. Estos resultados son de suma importancia epidemiológica, pero no permiten explicar los atributos patogénicos y de virulencia de este clon. El objetivo de este trabajo fue entonces, estudiar e identificar las bases moleculares y celulares de la virulencia de L. interrogans sv Pomona y establecer cómo contribuyen en su patogénesis. Para ello, se logró la atenuación de la cepa AKRFB Pasaje 1 (P1), perteneciente a dicho clon mayoritario, mediante subcultivos en medio líquido obteniéndose su contraparte atenuada en el Pasaje 19 (P19). La atenuación se confirmó inoculando hámsters (modelo de enfermedad aguda). Los animales infectados con P19 presentaron una sobrevida del 100% a los 21 días post infección (dpi), mientras que los infectados con P1 murieron entre a los 5 y 7 dpi. Los análisis histopatológicos confirmaron lo observado a nivel macroscópico, observándose infiltraciones alveolares e inflamación en tejido pulmonar de animales infectados con P1 y no así en P19. Estos resultados indican la rápida diseminación y colonización de diferentes tejidos por P1, confirmando así su virulencia y su posible transmisión luego de ser eliminada en la orina de los animales. Por otra parte, se observaron tasas diferenciales de crecimiento in vitro entre ambas cepas a favor de P1. Ésta alcanza rápidamente la fase exponencial (7-10 días) entrando en fase estacionaria pasados los 20 días de cultivo. Por el contrario, P19 entra rápidamente en fase estacionaria a los 7 días de iniciado el cultivo. Esto sugiere una mejor adaptación al crecimiento in vitro por parte de P1, en cambio las modificaciones en el genoma de P19 podrían haber impactado en el fitness de dicha cepa a las condiciones cambiantes del medio a través del tiempo. A fin de identificar dichos cambios genéticos se compararon los genomas y transcriptomas in vitro de P1 y P19 utilizando plataformas de secuenciación masiva. Si bien no se identificaron modificaciones de tipo estructural o INDELS (inserciones/deleciones), mediante el análisis de polimorfismos de nucléotido único (SNPs), se identificaron en P19 cambios no sinónimos de aminoácidos en proteínas correspondientes a superfamilias de catalasas (katE), y transportadores de lipoproteínas de membrana externa (lolA), entre otros. El análisis de expresión (RNAseq) identificó 328 transcriptos diferenciales entre P1 y P19, de los cuales 180 corresponden a P1 (54,88 %) y 148 a P19 (45,12 %). Entre los transcriptos sobreexpresados en P1 se identificaron reguladores transcripcionales, reguladores de sistemas de dos componentes, transportadores de membrana, etc. Contrariamente, la mayoría de los transcriptos sobreexpresados en P19 corresponden a genes que codifican para transposasas. Si bien la atenuación de P19 no puede atribuirse a un cambio puntual o a los genes diferencialmente expresados, el conjunto de los mismos podría ser la causa del fenotipo atenuado. Finalmente, y con el objetivo de evaluar la respuesta ante la infección con L. interrogans sv Pomona en un modelo que se aproxime al hospedador último de este patógeno, se utilizaron macrófagos bovinos derivados de monocitos (BMDMs). Las células infectadas con ambas cepas presentaron sobreexpresión de distintos inmunomoduladores, IL-1β, IL-6, IL-10 y TNFα respecto de las células sin infectar, pero cabe destacar que P1 indujo niveles de expresión de IL-10 mayores que P19, lo que estaría relacionado con la persistencia del patógeno como estrategia evasiva del sistema inmune del hospedador. Asimismo, en este trabajo se describieron por primera vez trampas extracelulares de macrófagos bovinos (bMETs) generadas por la infección de leptospiras y se observó que estas estructuras fueron inducidas de manera similar por ambas cepas. Por otro lado, P1 presentó mayor grado de internalización co-localizando con compartimentos endosomales ácidicos tardíos encomparación con P19. Esto también se observó cuando se inhibió la fagocitosis, lo que sugiere un ingreso a las células también por una vía independiente de fagocitosis. En suma, los resultados obtenidos indican una posible subversión de la respuesta inmune innata por parte de P1, y exponen la necesidad de profundizar en los mecanismos de invasión a macrófagos bovinos subrayando la importancia de estudiar al hospedador primario. Además, la identificación de mutaciones puntales y factores de virulencia diferencialmente expresados constituye un punto de partida clave para la generación de diagnósticos diferenciales y nuevas vacunas específicas contra la leptospirosis tanto bovina como humana. Este trabajo permitió entonces, profundizar en el conocimiento de la virulencia de Leptospira interrogans y su patogénesis en el modelo bovino, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizado en nuestro país. |
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