Caracterización molecular y celular de la virulencia de un clon mayoritario de Leptospira interrogans en Argentina

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Leptospira interrogans es el principal agente causal de la leptospirosis. La enfermedad constituye la zoonosis de mayor distribución mundial debido a que se contrae a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la vía principal de transmisión es el agua. La...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Nagel, Ariel Gastón
Otros Autores:	Caimi, Karina Cynthia
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2019
Materias:	LEPTOSPIRA POMONA ATENUADA VIRULENTA MACROFAGOS BOVINOS HAMSTERS INMUNIDAD INNATA GENOMICA TRANSCRIPTOMICA ATTENUATED VIRULENT BOVINE MACROPHAGES INNATE IMMUNITY GENOMICS TRANSCRIPTOMICS
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6944_Nagel http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6944_Nagel_oai
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description	Leptospira interrogans es el principal agente causal de la leptospirosis. La enfermedad constituye la zoonosis de mayor distribución mundial debido a que se contrae a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la vía principal de transmisión es el agua. Las leptospiras patógenas se clasifican en serovares (sv) con diferente seroprevalencias de acuerdo al hospedador y la localización geográfica. A diferencia de lo que ocurre en otros países, en Argentina el serovar mayoritario en bovinos es Pomona. Esta serovariedad produce una infección severa siendo frecuente la mortalidad en terneros. Resultados previos de nuestro grupo, permitieron identificar al serovar Pomona y genotipos asociados, como mayoritarios entre aislamientos provenientes de bovinos, pero también de humanos. Estos resultados son de suma importancia epidemiológica, pero no permiten explicar los atributos patogénicos y de virulencia de este clon. El objetivo de este trabajo fue entonces, estudiar e identificar las bases moleculares y celulares de la virulencia de L. interrogans sv Pomona y establecer cómo contribuyen en su patogénesis. Para ello, se logró la atenuación de la cepa AKRFB Pasaje 1 (P1), perteneciente a dicho clon mayoritario, mediante subcultivos en medio líquido obteniéndose su contraparte atenuada en el Pasaje 19 (P19). La atenuación se confirmó inoculando hámsters (modelo de enfermedad aguda). Los animales infectados con P19 presentaron una sobrevida del 100% a los 21 días post infección (dpi), mientras que los infectados con P1 murieron entre a los 5 y 7 dpi. Los análisis histopatológicos confirmaron lo observado a nivel macroscópico, observándose infiltraciones alveolares e inflamación en tejido pulmonar de animales infectados con P1 y no así en P19. Estos resultados indican la rápida diseminación y colonización de diferentes tejidos por P1, confirmando así su virulencia y su posible transmisión luego de ser eliminada en la orina de los animales. Por otra parte, se observaron tasas diferenciales de crecimiento in vitro entre ambas cepas a favor de P1. Ésta alcanza rápidamente la fase exponencial (7-10 días) entrando en fase estacionaria pasados los 20 días de cultivo. Por el contrario, P19 entra rápidamente en fase estacionaria a los 7 días de iniciado el cultivo. Esto sugiere una mejor adaptación al crecimiento in vitro por parte de P1, en cambio las modificaciones en el genoma de P19 podrían haber impactado en el fitness de dicha cepa a las condiciones cambiantes del medio a través del tiempo. A fin de identificar dichos cambios genéticos se compararon los genomas y transcriptomas in vitro de P1 y P19 utilizando plataformas de secuenciación masiva. Si bien no se identificaron modificaciones de tipo estructural o INDELS (inserciones/deleciones), mediante el análisis de polimorfismos de nucléotido único (SNPs), se identificaron en P19 cambios no sinónimos de aminoácidos en proteínas correspondientes a superfamilias de catalasas (katE), y transportadores de lipoproteínas de membrana externa (lolA), entre otros. El análisis de expresión (RNAseq) identificó 328 transcriptos diferenciales entre P1 y P19, de los cuales 180 corresponden a P1 (54,88 %) y 148 a P19 (45,12 %). Entre los transcriptos sobreexpresados en P1 se identificaron reguladores transcripcionales, reguladores de sistemas de dos componentes, transportadores de membrana, etc. Contrariamente, la mayoría de los transcriptos sobreexpresados en P19 corresponden a genes que codifican para transposasas. Si bien la atenuación de P19 no puede atribuirse a un cambio puntual o a los genes diferencialmente expresados, el conjunto de los mismos podría ser la causa del fenotipo atenuado. Finalmente, y con el objetivo de evaluar la respuesta ante la infección con L. interrogans sv Pomona en un modelo que se aproxime al hospedador último de este patógeno, se utilizaron macrófagos bovinos derivados de monocitos (BMDMs). Las células infectadas con ambas cepas presentaron sobreexpresión de distintos inmunomoduladores, IL-1β, IL-6, IL-10 y TNFα respecto de las células sin infectar, pero cabe destacar que P1 indujo niveles de expresión de IL-10 mayores que P19, lo que estaría relacionado con la persistencia del patógeno como estrategia evasiva del sistema inmune del hospedador. Asimismo, en este trabajo se describieron por primera vez trampas extracelulares de macrófagos bovinos (bMETs) generadas por la infección de leptospiras y se observó que estas estructuras fueron inducidas de manera similar por ambas cepas. Por otro lado, P1 presentó mayor grado de internalización co-localizando con compartimentos endosomales ácidicos tardíos encomparación con P19. Esto también se observó cuando se inhibió la fagocitosis, lo que sugiere un ingreso a las células también por una vía independiente de fagocitosis. En suma, los resultados obtenidos indican una posible subversión de la respuesta inmune innata por parte de P1, y exponen la necesidad de profundizar en los mecanismos de invasión a macrófagos bovinos subrayando la importancia de estudiar al hospedador primario. Además, la identificación de mutaciones puntales y factores de virulencia diferencialmente expresados constituye un punto de partida clave para la generación de diagnósticos diferenciales y nuevas vacunas específicas contra la leptospirosis tanto bovina como humana. Este trabajo permitió entonces, profundizar en el conocimiento de la virulencia de Leptospira interrogans y su patogénesis en el modelo bovino, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizado en nuestro país.
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spelling	I28-R145-tesis_n6944_Nagel_oai2023-04-26 Caimi, Karina Cynthia Nagel, Ariel Gastón 2019-03-22 Leptospira interrogans es el principal agente causal de la leptospirosis. La enfermedad constituye la zoonosis de mayor distribución mundial debido a que se contrae a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la vía principal de transmisión es el agua. Las leptospiras patógenas se clasifican en serovares (sv) con diferente seroprevalencias de acuerdo al hospedador y la localización geográfica. A diferencia de lo que ocurre en otros países, en Argentina el serovar mayoritario en bovinos es Pomona. Esta serovariedad produce una infección severa siendo frecuente la mortalidad en terneros. Resultados previos de nuestro grupo, permitieron identificar al serovar Pomona y genotipos asociados, como mayoritarios entre aislamientos provenientes de bovinos, pero también de humanos. Estos resultados son de suma importancia epidemiológica, pero no permiten explicar los atributos patogénicos y de virulencia de este clon. El objetivo de este trabajo fue entonces, estudiar e identificar las bases moleculares y celulares de la virulencia de L. interrogans sv Pomona y establecer cómo contribuyen en su patogénesis. Para ello, se logró la atenuación de la cepa AKRFB Pasaje 1 (P1), perteneciente a dicho clon mayoritario, mediante subcultivos en medio líquido obteniéndose su contraparte atenuada en el Pasaje 19 (P19). La atenuación se confirmó inoculando hámsters (modelo de enfermedad aguda). Los animales infectados con P19 presentaron una sobrevida del 100% a los 21 días post infección (dpi), mientras que los infectados con P1 murieron entre a los 5 y 7 dpi. Los análisis histopatológicos confirmaron lo observado a nivel macroscópico, observándose infiltraciones alveolares e inflamación en tejido pulmonar de animales infectados con P1 y no así en P19. Estos resultados indican la rápida diseminación y colonización de diferentes tejidos por P1, confirmando así su virulencia y su posible transmisión luego de ser eliminada en la orina de los animales. Por otra parte, se observaron tasas diferenciales de crecimiento in vitro entre ambas cepas a favor de P1. Ésta alcanza rápidamente la fase exponencial (7-10 días) entrando en fase estacionaria pasados los 20 días de cultivo. Por el contrario, P19 entra rápidamente en fase estacionaria a los 7 días de iniciado el cultivo. Esto sugiere una mejor adaptación al crecimiento in vitro por parte de P1, en cambio las modificaciones en el genoma de P19 podrían haber impactado en el fitness de dicha cepa a las condiciones cambiantes del medio a través del tiempo. A fin de identificar dichos cambios genéticos se compararon los genomas y transcriptomas in vitro de P1 y P19 utilizando plataformas de secuenciación masiva. Si bien no se identificaron modificaciones de tipo estructural o INDELS (inserciones/deleciones), mediante el análisis de polimorfismos de nucléotido único (SNPs), se identificaron en P19 cambios no sinónimos de aminoácidos en proteínas correspondientes a superfamilias de catalasas (katE), y transportadores de lipoproteínas de membrana externa (lolA), entre otros. El análisis de expresión (RNAseq) identificó 328 transcriptos diferenciales entre P1 y P19, de los cuales 180 corresponden a P1 (54,88 %) y 148 a P19 (45,12 %). Entre los transcriptos sobreexpresados en P1 se identificaron reguladores transcripcionales, reguladores de sistemas de dos componentes, transportadores de membrana, etc. Contrariamente, la mayoría de los transcriptos sobreexpresados en P19 corresponden a genes que codifican para transposasas. Si bien la atenuación de P19 no puede atribuirse a un cambio puntual o a los genes diferencialmente expresados, el conjunto de los mismos podría ser la causa del fenotipo atenuado. Finalmente, y con el objetivo de evaluar la respuesta ante la infección con L. interrogans sv Pomona en un modelo que se aproxime al hospedador último de este patógeno, se utilizaron macrófagos bovinos derivados de monocitos (BMDMs). Las células infectadas con ambas cepas presentaron sobreexpresión de distintos inmunomoduladores, IL-1β, IL-6, IL-10 y TNFα respecto de las células sin infectar, pero cabe destacar que P1 indujo niveles de expresión de IL-10 mayores que P19, lo que estaría relacionado con la persistencia del patógeno como estrategia evasiva del sistema inmune del hospedador. Asimismo, en este trabajo se describieron por primera vez trampas extracelulares de macrófagos bovinos (bMETs) generadas por la infección de leptospiras y se observó que estas estructuras fueron inducidas de manera similar por ambas cepas. Por otro lado, P1 presentó mayor grado de internalización co-localizando con compartimentos endosomales ácidicos tardíos encomparación con P19. Esto también se observó cuando se inhibió la fagocitosis, lo que sugiere un ingreso a las células también por una vía independiente de fagocitosis. En suma, los resultados obtenidos indican una posible subversión de la respuesta inmune innata por parte de P1, y exponen la necesidad de profundizar en los mecanismos de invasión a macrófagos bovinos subrayando la importancia de estudiar al hospedador primario. Además, la identificación de mutaciones puntales y factores de virulencia diferencialmente expresados constituye un punto de partida clave para la generación de diagnósticos diferenciales y nuevas vacunas específicas contra la leptospirosis tanto bovina como humana. Este trabajo permitió entonces, profundizar en el conocimiento de la virulencia de Leptospira interrogans y su patogénesis en el modelo bovino, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizado en nuestro país. Leptospira interrogans is the main agent of leptospirosis. The disease constitutes a worldwide-distributed zoonosis because it is acquired through contact with environments contaminated with urine from infected animals, where the main transmission route is water. Pathogenic leptospires are classified in serovars (sv) with different seroprevalence according to the host and geographical location. Unlike what happens in other countries, in Argentina the major serovar in bovine is Pomona. This serovar causes a severe infection and mortality in calves is frequent. Previous results of our group allowed us to identify Pomona and its associated genotypes as a major clone circulating in argentine isolates in livestock but also in humans. Although, these results are epidemiologically important, the pathogenic or virulence attributes of this clone were unknown until now. The objective of this work was then, to characterize the molecular and cellular virulence of a L. interrogans sv Pomona and to establish how these contribute to its pathogenesis. For this purpose, the attenuation of the strain AKRFB Passage 1 (P1) that belong to the aforementioned clone, was achieved by multiple subcultures in liquid medium obtaining its attenuated counterpart in the Passage 19 (P19). The attenuation was confirmed by infections in hamsters (acute disease model). Animals infected with P19 had a survival rate of 100% at 21 days’ post infection (dpi), while those infected with P1 died between 5 and 7 dpi. Histopathology assay confirmed the macroscopic findings, because alveolar infiltration and inflammation in lung tissues were observed in animals infected with P1 in comparison with those infected with P19. These results indicate the rapid dissemination and different tissues colonization by the virulent strain, which suggests a possible transmission route after leptospires spilling through the urine of infected animals. On the other hand, differential in vitro growth rates were observed between both strains in favor of P1. This variant quickly reaches the exponential phase (7-10 days) and entering in the stationary phase after 20 days of growing. Conversely, the stationary phase is reached by P19 7 days after the beginning of growing. These results suggest a better adaptation of P1 to the growing in vitro, whereas genome modification in P19 could have impacted the fitness of this strain to the changing conditions of the medium over time. In order to identify such genetic changes, in vitro genomes and transcriptomes of P1 and P19 were compared using next generation sequencing platforms. Although structural modification or INDELS (insertions/deletions) were not found between the two strains, single nucleotide polymorphisms (SNPs) analysis of non-synonymous aminoacid changes in proteins corresponding to catalase (katE) and lipoprotein transporter of the external membrane (lolA) superfamilies were identified among others in P19. The expression analysis (RNAseq) identified 328 differential transcripts between P1 and P19, of which 180 correspond to P1 (54.88%) and 148 to P19 (45.12%). Transcriptional regulators, regulators of two-component systems, membrane transporters, etc. were identified among the up-regulated transcripts in P1. Conversely, most of the transcripts up-regulated in P19 correspond to genes that code for transposases. Although, the attenuation of P19 cannot be attributed to single point mutations or differentially expressed genes, the set of them could be the cause of the attenuated phenotype. Finally, in order to evaluate the response to infection with L. interrogans sv Pomona in a model that mimics the ultimate host of this pathogen, bovine macrophages derived from monocytes (BMDMs) were used. The cells infected with both strains presented overexpression of different immunomodulators, IL-1β, IL-6, IL-10 and TNFα compared to uninfected cells, but it should be noted that P1 induced higher IL-10 expression levels than P19. This could be related to the persistence of the pathogen as an evasive strategy of the host's immune system. Likewise, in this work we described for the first time extracellular traps of bovine macrophages (bMETs) elicited upon infection with leptospires. These structures were similarly induced by both strains. In contrast, P1 was found higher internalized and colocalized with acidic and late endosomal compartments compared with P19. This was also observed after inhibition of phagocytosis, which suggests a cell entrance also by an independent-phagocytosis pathway. In summary, these results indicate a possible subversion of the innate immune response by the virulent strain, and expose the need to deepen the mechanisms of invasion by leptospires in bovine macrophages and emphasize the importance of primary host studies. In addition, the identification of point mutations and differentially expressed genes constitutes a starting point for the generation of differential diagnoses and new specific vaccines against both bovine and human leptospirosis. This work deepens the knowledge of the virulence of Leptospira interrogans and its pathogenesis in the bovine model, constituting the first work of its kind carried out in our country. Fil: Nagel, Ariel Gastón. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6944_Nagel spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar LEPTOSPIRA POMONA ATENUADA VIRULENTA MACROFAGOS BOVINOS HAMSTERS INMUNIDAD INNATA GENOMICA TRANSCRIPTOMICA LEPTOSPIRA POMONA ATTENUATED VIRULENT BOVINE MACROPHAGES HAMSTERS INNATE IMMUNITY GENOMICS TRANSCRIPTOMICS Caracterización molecular y celular de la virulencia de un clon mayoritario de Leptospira interrogans en Argentina Molecular and cellular characterization of the virulence from a major clone of Leptospira interrogans in Argentina info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6944_Nagel_oai

Caracterización molecular y celular de la virulencia de un clon mayoritario de Leptospira interrogans en Argentina

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