Participación del citoesqueleto de actina y el calcio intracelular en el control de la exocitosis acrosomal espermática

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Los espermatozoides de mamífero adquieren su capacidad fecundante después de una serie de modificaciones bioquímicas en el tracto reproductor femenino, colectivamente llamadas capacitación. Estos cambios son esenciales para que los espermatozoides puedan realizarla exocitosis acrosomal (EA), un proc...

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Autor principal: Romarowski, Ana
Otros Autores: Buffone, Mariano G.
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2017
Materias:
ESPERMATOZOIDE
PEQUEÑAS GTPASAS
LIMK1
COFILIN
CITOESQUELETO DE ACTINA
EXOCITOSIS ACROSOMAL
CALCIO
PROGESTERONA
SPERM
SMALL GTPASES
ACTIN CYTOSKELETON
ACROSOMAL EXOCYTOSIS
CALCIUM
PROGESTERONE
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6238_Romarowski
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6238_Romarowski_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Los espermatozoides de mamífero adquieren su capacidad fecundante después de una serie de modificaciones bioquímicas en el tracto reproductor femenino, colectivamente llamadas capacitación. Estos cambios son esenciales para que los espermatozoides puedan realizarla exocitosis acrosomal (EA), un proceso que es fundamental para la fecundación. En este trabajo se estudiaron los cambios en el citoesqueleto de actina en la preparación para la ocurrencia de la EA así como también, los cambios en los niveles de calcio intracelular como evento fundamental para las etapas finales de la fusión de membranas. La dinámica del citoesqueleto de actina juega un rol central en controlar el proceso de exocitosis en células somáticas así como en los espermatozoides de varias especies demamíferos. A pesar de que en células somáticas, laspequeñas GTPasas de la familia Rho son ampliamente conocidas como reguladores principales de la dinámica dela actina, su función en espermatozoides es desconocida. En el presente trabajo se caracterizó la participación de las pequeñas GTPasas de la familia Rho en la vía de señalización que conduce a la polimerización de actina durante la capacitación del espermatozoide de ratón. Se observó que la mayoría de las proteínas de esta cascada de señalización y sus proteínas efectoras se expresan en el espermatozoide de ratón. La activación de las vías de señalización de AMPc/PKA, RhoA/C y Rac1 es esencial para la activación por fosforilación de LIMK1 en Treonina 508. Cofilin es fosforilada en Serina 3porLIMK1 durante la capacitación de manera transitoria. La inhibición de LIMK1 por un inhibidor específico (BMS-3) resultó en menores niveles de polimerización de actina durante la capacitación y una marcada disminución en el porcentaje de espermatozoides que realizan EA. Asimismo se sabe que es necesario un aumento en el Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) para que la EA se produzca. La progesterona producida por las células del cúmulus ha sido asociada con diversos procesos fisiológicos en los espermatozoides, incluyendo la estimulación de la EA. En este trabajo, investigamos la correlación espacio temporal entre los cambios en el [Ca2+]iy la EA en espermatozoidesindividuales de ratón en respuesta a la progesterona. Se encontró que la progesterona estimula un incremento en el [Ca2+]i encinco patrones diferentes: gradual,oscilatorio, transitorio tardío, transitorioinmediato, y sostenido.Tambiénse observó que el aumento en el [Ca2+]ipromovido por la progesterona puedecomenzar tanto en el flagelo como en la cabeza del espermatozoide. Se validó la utilización de FM4-64 como un indicador de la ocurrencia de la EA mediante la detección simultánea del aumento de su fluorescencia y la pérdida del EGFP en espermatozoides transgénicos EGFPAcr. Por primera vez, se logró visualizar simultáneamente el aumento en el [Ca2+]i y el proceso de exocitosis en respuesta a la progesterona, observándose que sólo un aumento transitorio específico en el [Ca2+]i originado en la cabeza del espermatozoide promueve la iniciación de la EA. En conclusión, en esta tesis se logró evidenciar la importanciade las pequeñas GTPasas de la familia Rho y sus efectores principales LIMK1 y Cofilin en la regulación de la dinámica del citoesqueleto de actina en la preparación del espermatozoide para poder realizar la EA. A su vez, se identificó el tipo de aumento de [Ca2+]i específico que es necesario para iniciar los eventos finales de la EA estimulada por progesterona.
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spelling I28-R145-tesis_n6238_Romarowski_oai2023-04-26 Buffone, Mariano G. Romarowski, Ana 2017-03-16 Los espermatozoides de mamífero adquieren su capacidad fecundante después de una serie de modificaciones bioquímicas en el tracto reproductor femenino, colectivamente llamadas capacitación. Estos cambios son esenciales para que los espermatozoides puedan realizarla exocitosis acrosomal (EA), un proceso que es fundamental para la fecundación. En este trabajo se estudiaron los cambios en el citoesqueleto de actina en la preparación para la ocurrencia de la EA así como también, los cambios en los niveles de calcio intracelular como evento fundamental para las etapas finales de la fusión de membranas. La dinámica del citoesqueleto de actina juega un rol central en controlar el proceso de exocitosis en células somáticas así como en los espermatozoides de varias especies demamíferos. A pesar de que en células somáticas, laspequeñas GTPasas de la familia Rho son ampliamente conocidas como reguladores principales de la dinámica dela actina, su función en espermatozoides es desconocida. En el presente trabajo se caracterizó la participación de las pequeñas GTPasas de la familia Rho en la vía de señalización que conduce a la polimerización de actina durante la capacitación del espermatozoide de ratón. Se observó que la mayoría de las proteínas de esta cascada de señalización y sus proteínas efectoras se expresan en el espermatozoide de ratón. La activación de las vías de señalización de AMPc/PKA, RhoA/C y Rac1 es esencial para la activación por fosforilación de LIMK1 en Treonina 508. Cofilin es fosforilada en Serina 3porLIMK1 durante la capacitación de manera transitoria. La inhibición de LIMK1 por un inhibidor específico (BMS-3) resultó en menores niveles de polimerización de actina durante la capacitación y una marcada disminución en el porcentaje de espermatozoides que realizan EA. Asimismo se sabe que es necesario un aumento en el Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) para que la EA se produzca. La progesterona producida por las células del cúmulus ha sido asociada con diversos procesos fisiológicos en los espermatozoides, incluyendo la estimulación de la EA. En este trabajo, investigamos la correlación espacio temporal entre los cambios en el [Ca2+]iy la EA en espermatozoidesindividuales de ratón en respuesta a la progesterona. Se encontró que la progesterona estimula un incremento en el [Ca2+]i encinco patrones diferentes: gradual,oscilatorio, transitorio tardío, transitorioinmediato, y sostenido.Tambiénse observó que el aumento en el [Ca2+]ipromovido por la progesterona puedecomenzar tanto en el flagelo como en la cabeza del espermatozoide. Se validó la utilización de FM4-64 como un indicador de la ocurrencia de la EA mediante la detección simultánea del aumento de su fluorescencia y la pérdida del EGFP en espermatozoides transgénicos EGFPAcr. Por primera vez, se logró visualizar simultáneamente el aumento en el [Ca2+]i y el proceso de exocitosis en respuesta a la progesterona, observándose que sólo un aumento transitorio específico en el [Ca2+]i originado en la cabeza del espermatozoide promueve la iniciación de la EA. En conclusión, en esta tesis se logró evidenciar la importanciade las pequeñas GTPasas de la familia Rho y sus efectores principales LIMK1 y Cofilin en la regulación de la dinámica del citoesqueleto de actina en la preparación del espermatozoide para poder realizar la EA. A su vez, se identificó el tipo de aumento de [Ca2+]i específico que es necesario para iniciar los eventos finales de la EA estimulada por progesterona. Mammalia sperm must acquire their fertilizing ability after a series of biochemical modifications in the female reproductive tract collectively called capacitation to undergo acrosomal exocytosis (AE), a process that is essential for fertilization. In this work, the changes in the actin cytoskeleton in preparation for the occurrence of the AE as well as the changes in intracellular calcium levels as a crucial event to the final stages of membrane fusion, were studied. Actin dynamics play a central role in controlling the process of exocytosis in somatic cells as well as in sperm from several mammalian species. In somatic cells, small GTPases of the Rho family are widely known as master regulators of actin dynamics. However, the role of these proteins in sperm has not been studied in detail. In the present work the role of the small GTPases of the Rho family in the signaling pathway that leads to actin polymerization during mouse sperm capacitation was studied. It was observed that most of the proteins of this signaling cascade and their downstream effector proteins are expressed in mouse sperm. The activation of the cAMP/PKA, RhoA/C and Rac1 signaling pathways are essential for LIMK1 activation by phosphorylation on Threonine 508. Serine 3 of Cofilin is phosphorylated by LIMK1 during capacitation in a transiently manner. Inhibition of LIMK1 by specific inhibitors (BMS-3) resulted in lower levels of actin polymerization during capacitation and a dramatic decrease in the percentage of sperm that undergo acrosomal exocytosis. In addition, it is well known that an increase in intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) is necessary for AE to occur. Progesterone produced by cumulus cells has been associated with various physiological processes in sperm, including stimulation of AE. In this study, the spatio-temporal correlation between the changes in [Ca2+]i and AEin single mouse spermatozoa in response to progesterone was investigated. Progesterone stimulated an [Ca2+]i increase in five different patterns: gradual, oscillatory, late transitory, immediate transitory and sustained. It was also observed that the [Ca2+]i increase promoted by progesterone started at either the flagellum or the head. The use of FM4-64 as an indicator for the occurrence of the AE was validated by simultaneously detecting its fluorescence increase and the loss of EGFP in transgenic EGFPAcr sperm. For the first time, it was simultaneously visualized the rise in [Ca2+]i at the onset of AE in response to progesterone. Only a specific transitory increase in [Ca2+]i originated in the sperm head promoted the initiation of AE. In conclusion, in this thesis it was demonstrated the importance of the small GTPases of the Rho family and its main effector proteins LIMK1 and Cofilin in the regulation of the actin cytoskeleton in preparation for AE. Moreover, it was identified the type of [Ca2 +]i increase necessary to trigger the final events of AE induced by progesterone. Fil: Romarowski, Ana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6238_Romarowski spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar ESPERMATOZOIDE PEQUEÑAS GTPASAS LIMK1 COFILIN CITOESQUELETO DE ACTINA EXOCITOSIS ACROSOMAL CALCIO PROGESTERONA SPERM SMALL GTPASES LIMK1 COFILIN ACTIN CYTOSKELETON ACROSOMAL EXOCYTOSIS CALCIUM PROGESTERONE Participación del citoesqueleto de actina y el calcio intracelular en el control de la exocitosis acrosomal espermática Involvement of actin cytoskeleton and intracellular calcium in the control of sperm acrosomal exocytosis info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6238_Romarowski_oai

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