Acumulación de biomasa y calidad de frutos : el papel de las invertasas en caracteres de interés biotecnológico

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Las invertasas son β-D-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26) que hidrolizan la sacarosa irreversiblemente a glucosa y fructosa. Hasta la fecha, se han identificado diferentes isoformas de invertasas que se clasificaron según su localización sub-celular en: a) solubles, las cuales se encuentran en citoso...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Coluccio Leskow, Carla
Otros Autores:	Carrari, Fernando
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2016
Materias:	ARABIDOPSIS QUANTITATIVE TRAIT LOCI (QTL) INVERTASA VACUOLAR BIOMASA LINEAS INTROGRESADAS INHIBIDOR QUANTITATIVE TRAIT LOCI VACUOLAR INVERTASE BIOMASS NEAR ISOGENIC LINE INHIBITOR
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6129_ColuccioLeskow http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6129_ColuccioLeskow_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	Las invertasas son β-D-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26) que hidrolizan la sacarosa irreversiblemente a glucosa y fructosa. Hasta la fecha, se han identificado diferentes isoformas de invertasas que se clasificaron según su localización sub-celular en: a) solubles, las cuales se encuentran en citosol o vacuola, o b) insolubles, las cuales están unidas a componentes de la pared celular. En el marco de esta tesis doctoral se analizó el papel de dos enzimas invertasas, una vacuolar (At1g12240-Inv-vac) y una citosólica (Solyc04g081440-Slalk/ne-INV) en la acumulación de biomasa y distribución y composición del carbono en plantas superiores utilizando como modelo Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum, respectivamente. A través de mapeo de QTLs se demostró que una invertasa vacuolar (Inv-vac) juega un rol determinante en el largo radicular en Arabidopsis. El objetivo del presente trabajo en entender el mecanismo fundamental de este QTL a través del análisis de las diferencias estructurales y funcionales de Inv-vac en dos genotipos parentales (Ler y CVI) y dos líneas introgresadas (N-14 y N-15) portando segmentos genómicos individuales de CVI, conteniendo al locus At1g12240, en el fondo genético de Ler. Se analizó la abundancia relativa de los transcriptos por qRT-PCR la cual mostro patrones de expresión similares entre ambos ecotipos. Sin embargo, el análisis de secuencia de ADN revelo varios polimorfismos que provocan cambios en la secuencia de la proteína correspondiente entre ellos. A su vez, ensayos de actividad en extractos de proteínas totales mostraron mayor actividad invertasa en los genotipos conteniendo el alelo de CVI mientras que los ensayos cinéticos utilizando proteínas recombinantes purificadas revelaron Km similares para ambos alelos y una Vmax ligeramente mayor para el alelo Ler. Tratamientos de extractos de plántulas con agitación y temperatura para minimizar la actividad de posibles inhibidores de invertasa provocaron un aumento importante en la actividad de Ler sin modificar la actividad de los genotipos conteniendo el alelo CVI. Análisis de qRT-PCR de dos inhibidores de invertasa vacuolar en plántulas de los 4 genotipos revelo patrones de expresión diferencial entre ellos. En conjunto, los resultados obtenidos demuestran que el QTL de invertasa vacuolar afecta la acumulación de biomasa radicular y la partición de carbono a través de una regulación diferencial de los inhibidores a nivel ARNm. Para el caso de Solanum lycopersicum, se obtuvieron plantas transgénicas silenciadas por ARNi para el gen que codifica para una invertasa alcalina neutra (Slalk/ne-INV) y se realizó una fenotipificación de las plantas que mostraron diferencias contrastantes con respecto al wild type, mayormente en la aparición de flores y seteo de frutos. A su vez, a través del análisis de acumulación de mensajero por qRT-PCR se observó un aumento de los niveles de expresión de LIN4 durante el desarrollo de los frutos que da cuenta de la importancia de esta enzima en los órganos destino. Los niveles de los principales carbohidratos solubles se midieron a lo largo de un periodo diurno en hojas fuente y la actividad de enzimas centrales del metabolismo de carbono fueron medidas en hojas y frutos rojos de las líneas transgénicas. Por otra parte, se obtuvieron perfiles metabólicos de hojas y frutos de las plantas transgénicas aplicando GC-MS y se realizaron experimentos de acumulación de ARNm por secuenciación masiva (RNAseq). El análisis conjunto de los datos de RNAseq y metabolómica muestran que el silenciamiento de la enzima Slalk/ne-INV genera un aumento de la expresión de genes involucrados principalmente en respuesta a estrés, defensa y muerte celular programada apoyando la idea de un papel principal de esta enzima sobre el metabolismo global de la planta, el crecimiento y la reproducción vinculando la adaptación al estrés, con los azucares y las señales del desarrollo.
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El objetivo del presente trabajo en entender el mecanismo fundamental de este QTL a través del análisis de las diferencias estructurales y funcionales de Inv-vac en dos genotipos parentales (Ler y CVI) y dos líneas introgresadas (N-14 y N-15) portando segmentos genómicos individuales de CVI, conteniendo al locus At1g12240, en el fondo genético de Ler. Se analizó la abundancia relativa de los transcriptos por qRT-PCR la cual mostro patrones de expresión similares entre ambos ecotipos. Sin embargo, el análisis de secuencia de ADN revelo varios polimorfismos que provocan cambios en la secuencia de la proteína correspondiente entre ellos. A su vez, ensayos de actividad en extractos de proteínas totales mostraron mayor actividad invertasa en los genotipos conteniendo el alelo de CVI mientras que los ensayos cinéticos utilizando proteínas recombinantes purificadas revelaron Km similares para ambos alelos y una Vmax ligeramente mayor para el alelo Ler. Tratamientos de extractos de plántulas con agitación y temperatura para minimizar la actividad de posibles inhibidores de invertasa provocaron un aumento importante en la actividad de Ler sin modificar la actividad de los genotipos conteniendo el alelo CVI. Análisis de qRT-PCR de dos inhibidores de invertasa vacuolar en plántulas de los 4 genotipos revelo patrones de expresión diferencial entre ellos. En conjunto, los resultados obtenidos demuestran que el QTL de invertasa vacuolar afecta la acumulación de biomasa radicular y la partición de carbono a través de una regulación diferencial de los inhibidores a nivel ARNm. Para el caso de Solanum lycopersicum, se obtuvieron plantas transgénicas silenciadas por ARNi para el gen que codifica para una invertasa alcalina neutra (Slalk/ne-INV) y se realizó una fenotipificación de las plantas que mostraron diferencias contrastantes con respecto al wild type, mayormente en la aparición de flores y seteo de frutos. A su vez, a través del análisis de acumulación de mensajero por qRT-PCR se observó un aumento de los niveles de expresión de LIN4 durante el desarrollo de los frutos que da cuenta de la importancia de esta enzima en los órganos destino. Los niveles de los principales carbohidratos solubles se midieron a lo largo de un periodo diurno en hojas fuente y la actividad de enzimas centrales del metabolismo de carbono fueron medidas en hojas y frutos rojos de las líneas transgénicas. Por otra parte, se obtuvieron perfiles metabólicos de hojas y frutos de las plantas transgénicas aplicando GC-MS y se realizaron experimentos de acumulación de ARNm por secuenciación masiva (RNAseq). El análisis conjunto de los datos de RNAseq y metabolómica muestran que el silenciamiento de la enzima Slalk/ne-INV genera un aumento de la expresión de genes involucrados principalmente en respuesta a estrés, defensa y muerte celular programada apoyando la idea de un papel principal de esta enzima sobre el metabolismo global de la planta, el crecimiento y la reproducción vinculando la adaptación al estrés, con los azucares y las señales del desarrollo. Invertases are β-D-fructofuranosidases (EC 3.2.1.26) which hydrolyzes sucrose into glucose and fructose irreversibly. To date, different isoforms of invertase have been identified that were classified according to their subcellular localization: a) soluble, which are in cytosol or vacuole, or b) insoluble, which are attached to components of the cell wall. As part of this thesis we analyzed the role of two invertases, a vacuolar (At1g12240-Inv-vac) and a cytosolic (Solyc04g081440-Slalk/ne-INV) in biomass accumulation and distribution and composition of carbon in higher plants using as models Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum, respectively. By Quantitative Trait Locus (QTL) mapping it has been demonstrated that a vacuolar invertase (vac-Inv) plays a key role determining the radical length in Arabidopsis. In this model, variation in vac-Inv activity was detected in a Near Isogenic Line (NIL) population derived from a cross between two divergent accessions; Landsberg erecta (Ler) and Cape Verde Island (CVI), with the CVI allele conferring both higher Inv activity and longer radicles. The aim of the current work is to understand the mechanism(s) underlying this QTL by analyzing structural and functional differences of vac-Inv from both accessions. Relative transcript abundance analyzed by qRT-PCR showed similar expression patterns in both accessions, however, DNA sequence analyses revealed several polymorphisms that lead to changes in the corresponding protein sequence between them. Moreover, activity assays revealed higher vac-Inv activity in genotypes carrying the CVI allele than the Ler one. Analyses of purified recombinant proteins showed a similar Km for both alleles and a slightly higher Vmax for the Ler one. Treatment of plant extracts with foaming to release possible interacting invertase inhibitory protein/s (Inv-inh) led to a large increase in activity for the Ler-allele, but no changes for genotypes carrying the CVI one. qRT-PCR analyses of two vac-Inv inhibitors in seedlings from parental and NILs genotypes revealed different expression patterns between them. Taken together these results demonstrate that the vac-INV-QTL affects root biomass accumulation and also carbon partitioning through a differential regulation of the vac-Inv inhibitors at the mRNA level. In the case of Solanum lycopersicum, a RNA interference (RNAi) approach was followed to generate transgenic plants silencing the LIN4 (Slalk/ne-INV) expression and phenotypic analyses were made over the plants that showed differences in respect to the wild type line mainly in flower appearance and fruit set. At the same time, through the analyses of mRNA accumulation by qRT-PCR an increase in the expression levels of LIN4 was observed during fruit development which point to the importance of this enzyme in sink organs and during tomato fruit development. The content of the main soluble carbohydrates were measured along a diurnal period in source leaves and the activity of enzymes from central metabolism were measured in leaves and ripe fruits of transgenic lines. Moreover, metabolic profiles were obtained by GC-MS over leaves and fruits of transgenic lines and RNA accumulation experiments were performed by high throughput sequencing (RNAseq). Taken together, the RNAseq and metabolomic data show that the silenced of the Slalk/ne-INV enzyme generates an increased expression of genes involved primarily in response to stress, defense and programmed cell death supporting the idea of a major role of this enzyme on the overall plant metabolism, growth and reproduction linking adaptation to stress, with sugars and developmental signals. Fil: Coluccio Leskow, Carla. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6129_ColuccioLeskow spa Universidad de Buenos Aires. 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Acumulación de biomasa y calidad de frutos : el papel de las invertasas en caracteres de interés biotecnológico

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