Estudio transcripcional y post-transcripcional de la quinasa de proteínas dependiente de calcio, StCDPK1 en Solanum tuberosum y análisis de sus potenciales blancos de acción

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La papa, Solanum tuberosum L., es el tercer cultivo alimenticio luego del arroz y del trigo (FAOSTAT, 2009). En el proceso de tuberización, un tallo subterráneo especializado, el estolón, sediferencia en un órgano de reserva, el tubérculo. Con el fin de comprender los mecanismos quesubyacen a este p...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Santin, Franco
Otros Autores:	Ulloa, Rita María
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2015
Materias:	STCDPK1 FOSFORILACION DEPENDIENTE DE CALCIO REGULACION TRANSCRIPCIONAL REGULACION POSTRANCRIPCIONAL POR MICRO ARNS TUBERIZACION CALCIUM DEPENDENT PHOSPHORYLATION TRANSCRIPTIONAL REGULATION POSTRANSCRIPTIONAL REGULATION BY MI RNAS TUBERIZATION
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5755_Santin https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5755_Santin_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	La papa, Solanum tuberosum L., es el tercer cultivo alimenticio luego del arroz y del trigo (FAOSTAT, 2009). En el proceso de tuberización, un tallo subterráneo especializado, el estolón, sediferencia en un órgano de reserva, el tubérculo. Con el fin de comprender los mecanismos quesubyacen a este proceso de desarrollo y para mejorar la calidad y el rendimiento del cultivo se hanrealizado numerosas investigaciones. Entre los diversos factores que regulan la tuberización, loscambios en los niveles intracelulares de calcio y en el estado de fosforilación de las proteínas soneventos primarios que coordinan en tiempo y forma la respuesta de la planta. El calcio es unsegundo mensajero esencial en plantas y las quinasas de proteínas dependientes de calcio, CDPKs,son sensores/transductores del catión que se inducen/activan en respuesta a estímulos bióticos yabióticos (Boudsocq & Sheen 2013). Estas enzimas monoméricas poseen un dominio quinasa deproteínas (DK) unido a través de una región bisagra o dominio autoinhibitorio (DAI) a un dominioregulador homólogo a la calmodulina (CLD) con 4 sitios de unión al calcio (EF-hands). Componenfamilias multigénicas compuestas por aproximadamente 30 miembros que presentan granhomología de secuencia entre sí a excepción del dominio amino terminal variable (NTV) queregula la localización subcelular de la enzima. En Solanum tuberosum, nuestro grupo identificó tresisoformas de CDPK, StCDPK1, 2 y 3, que se expresan durante el proceso de tuberización (Gargantini et al. 2009; Giammaria et al. 2011; Grandellis et al. 2012; Raices et al. 2001; Raices etal. 2003a; Raices et al. 2003b; Raices et al. 2003c). Con el fin de estudiar la regulación transcripcional de la isoforma StCDPK1 durante el ciclo de vidade la planta de papa, se clonó y analizó su secuencia promotora, se obtuvieron y caracterizaronplantas transgénicas de papa que expresan el gen reportero β-glucuronidasa (GUS) bajo dichopromotor (plantas StCDPK1pro::GUS) y se realizaron ensayos de qRT-PCR en diferentes tejidos dela planta y estadios de tuberización. Se comparó la actividad GUS observada en las plantas StCDPK1pro::GUS con la observada en plantas CDPK3pro::GUS desarrolladas previamente (Grandellis et al. 2012) y con la de plantas CDPK2pro::GUS obtenidas también durante eltranscurso de esta tesis. Los ensayos histoquímicos indican que la isoforma StCDPK1 estáfuertemente asociada al sistema vascular de la planta y confirman que presenta una expresiónespacio temporal definida durante el proceso de tuberización. Asimismo se analizó si la expresión de StCDPK1 podía ser regulada post transcripcionalmente pormicroARNs. A través de los programas online psRNATarget y TargetAlign se identificó el miR390que tendría como blanco el transcripto de StCDPK1 provocando el clivaje del ARNm ointerrumpiendo su traducción. Los perfiles de expresión opuestos del miR390 y de StCDPK1 enestadíos de tuberización indicaron que este miARN podría regular la expresión de StCDPK1. Posteriormente, en ensayos de co-agroinfiltración en Nicotiana benthamiana se determinó que lostranscriptos de StCDPK1 son blanco de acción del miR390, demostrando, por primera vez, que una CDPK es regulada a este nivel (manuscrito enviado a Plant Mol. Biol). Además se obtuvo la proteína recombinante StCDPK1 etiquetada con 6xHis para proceder a sucaracterización bioquímica y determinar sus parámetros cinéticos. Se demostró que la proteína 6xHis-StCDPK1 es una quinasa activa dependiente de calcio, capaz de autofosforilarse en presenciadel catión y que fosforila diversos sustratos, entre los cuales se encuentra AtDi19, un factor detranscripción involucrado en la respuesta a estrés salino y sequía en Arabidopsis thaliana. Recientemente obtuvimos las proteínas recombinantes del homólogo de AtDi19 en papa y otrasdos proteínas que han sido implicadas en la inducción de la tuberización, la proteína StSP6A,homólogo en papa de flowering locus T (FT) y StPIN4, un transportador de auxinas. Próximamentese ensayará la capacidad de la enzima de fosforilar in vitro a estos sustratos. Finalmente, seprodujeron plantas que sobrexpresan la proteína StCDPK1 como una primera aproximaciónfuncional para determinar si esta isoforma interviene en la respuesta de la planta a estresesabióticos.
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spelling	I28-R145-tesis_n5755_Santin_oai2024-09-02 Ulloa, Rita María Santin, Franco 2015-04-24 La papa, Solanum tuberosum L., es el tercer cultivo alimenticio luego del arroz y del trigo (FAOSTAT, 2009). En el proceso de tuberización, un tallo subterráneo especializado, el estolón, sediferencia en un órgano de reserva, el tubérculo. Con el fin de comprender los mecanismos quesubyacen a este proceso de desarrollo y para mejorar la calidad y el rendimiento del cultivo se hanrealizado numerosas investigaciones. Entre los diversos factores que regulan la tuberización, loscambios en los niveles intracelulares de calcio y en el estado de fosforilación de las proteínas soneventos primarios que coordinan en tiempo y forma la respuesta de la planta. El calcio es unsegundo mensajero esencial en plantas y las quinasas de proteínas dependientes de calcio, CDPKs,son sensores/transductores del catión que se inducen/activan en respuesta a estímulos bióticos yabióticos (Boudsocq & Sheen 2013). Estas enzimas monoméricas poseen un dominio quinasa deproteínas (DK) unido a través de una región bisagra o dominio autoinhibitorio (DAI) a un dominioregulador homólogo a la calmodulina (CLD) con 4 sitios de unión al calcio (EF-hands). Componenfamilias multigénicas compuestas por aproximadamente 30 miembros que presentan granhomología de secuencia entre sí a excepción del dominio amino terminal variable (NTV) queregula la localización subcelular de la enzima. En Solanum tuberosum, nuestro grupo identificó tresisoformas de CDPK, StCDPK1, 2 y 3, que se expresan durante el proceso de tuberización (Gargantini et al. 2009; Giammaria et al. 2011; Grandellis et al. 2012; Raices et al. 2001; Raices etal. 2003a; Raices et al. 2003b; Raices et al. 2003c). Con el fin de estudiar la regulación transcripcional de la isoforma StCDPK1 durante el ciclo de vidade la planta de papa, se clonó y analizó su secuencia promotora, se obtuvieron y caracterizaronplantas transgénicas de papa que expresan el gen reportero β-glucuronidasa (GUS) bajo dichopromotor (plantas StCDPK1pro::GUS) y se realizaron ensayos de qRT-PCR en diferentes tejidos dela planta y estadios de tuberización. Se comparó la actividad GUS observada en las plantas StCDPK1pro::GUS con la observada en plantas CDPK3pro::GUS desarrolladas previamente (Grandellis et al. 2012) y con la de plantas CDPK2pro::GUS obtenidas también durante eltranscurso de esta tesis. Los ensayos histoquímicos indican que la isoforma StCDPK1 estáfuertemente asociada al sistema vascular de la planta y confirman que presenta una expresiónespacio temporal definida durante el proceso de tuberización. Asimismo se analizó si la expresión de StCDPK1 podía ser regulada post transcripcionalmente pormicroARNs. A través de los programas online psRNATarget y TargetAlign se identificó el miR390que tendría como blanco el transcripto de StCDPK1 provocando el clivaje del ARNm ointerrumpiendo su traducción. Los perfiles de expresión opuestos del miR390 y de StCDPK1 enestadíos de tuberización indicaron que este miARN podría regular la expresión de StCDPK1. Posteriormente, en ensayos de co-agroinfiltración en Nicotiana benthamiana se determinó que lostranscriptos de StCDPK1 son blanco de acción del miR390, demostrando, por primera vez, que una CDPK es regulada a este nivel (manuscrito enviado a Plant Mol. Biol). Además se obtuvo la proteína recombinante StCDPK1 etiquetada con 6xHis para proceder a sucaracterización bioquímica y determinar sus parámetros cinéticos. Se demostró que la proteína 6xHis-StCDPK1 es una quinasa activa dependiente de calcio, capaz de autofosforilarse en presenciadel catión y que fosforila diversos sustratos, entre los cuales se encuentra AtDi19, un factor detranscripción involucrado en la respuesta a estrés salino y sequía en Arabidopsis thaliana. Recientemente obtuvimos las proteínas recombinantes del homólogo de AtDi19 en papa y otrasdos proteínas que han sido implicadas en la inducción de la tuberización, la proteína StSP6A,homólogo en papa de flowering locus T (FT) y StPIN4, un transportador de auxinas. Próximamentese ensayará la capacidad de la enzima de fosforilar in vitro a estos sustratos. Finalmente, seprodujeron plantas que sobrexpresan la proteína StCDPK1 como una primera aproximaciónfuncional para determinar si esta isoforma interviene en la respuesta de la planta a estresesabióticos. Potato (Solanum tuberosum L.) is the world's most important non-grain food crop. Tuberdevelopment (Tuberization) in potato has been extensively studied in order to understand themechanism as well as to improve tuber yield and quality. Among the many factors that regulatetuberization, calcium signaling plays an important role. Calcium is the key second messenger inplants and Calcium Dependent Protein Kinases (CDPKs) transduce calcium signatures into specificresponses including tuberization. These enzymes are encoded by multigene families, whosemembers share a unique structure consisting of an N-terminal variable domain (NTV), aserine/threonine kinase catalytic domain (KD) fused through a junction region or autoinhibitorydomain to a carboxyterminal calmodulin-like domain (CLD) with four EF hands Ca2+ binding sites. Previous reports from our group showed that CDPK activity increases at the onset of tuberformation and that StCDPK1 is strongly induced in swollen stolons (Gargantini et al. 2009; Giammaria et al. 2011; Grandellis et al. 2012; Raices et al. 2001; Raices et al. 2003a; Raices et al. 2003b; Raices et al. 2003c). To elucidate the transcription pattern and post transcriptional regulation of StCDPK1, we analyzedits expression in different tissues and stages of potato life cycle and characterized potato plantsharboring GUS under the control of StCDPK1 promoter (StCDPK1pro::GUS). Histochemical analysisindicates that StCDPK1 is strongly associated to the vascular system of stems, roots and duringstolon to tuber transition correlating with the cis-acting elements present in its promotersequence. qRT-PCR data demonstrated that StCDPK1 is ubiquitously expressed having highexpression in stolons, swollen stolons, leaves, and stems. On the contrary, miR390 expressionexhibited an inverse pattern in stolons, swollen stolons and tubers suggesting a possible regulationof StCDPK1 by miR390. This was further confirmed by Agrobacterium co-infiltration assays,demonstrating that StCDPK1 is targeted by miR390. Overall, our results indicate that StCDPK1expression varied in tissue specific manner having significant expression in vasculature, and itcould be modulated by miR390 during potato development. The recombinant 6xHis-StCDPK1 protein was produced and biochemically characterized. StCDPK1kinetic parameters differed from those exhibited by other isoforms, consistent with the fact that CDPKs are involved in various signal transduction pathways and are differentially expressed amongtissues. In addition, the kinase was autophosphorylated in the presence of calcium and 2D analysisrevealed multiple phosphorylation states as predicted by in silico analysis. This isoform was able tophosphorylate some targets in vitro, among which, AtDi19 was reported to be involved in salt anddrought stress in Arabidopsis thaliana. Recently, we produced the recombinant proteins of thepotato homolog of AtDi19 (StDi19) as well as two other proteins implicated in tuber induction, StSP6A and StPIN4. Shortly, the capability of StCDPK1 to phosphorylate these proteins will beassayed in vitro. Finally, 35S::StCDPK1 over-expressing plants were produced as a first functionalapproach to study the role of this isoform in the abiotic stress response. Fil: Santin, Franco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5755_Santin spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar STCDPK1 FOSFORILACION DEPENDIENTE DE CALCIO REGULACION TRANSCRIPCIONAL REGULACION POSTRANCRIPCIONAL POR MICRO ARNS TUBERIZACION STCDPK1 CALCIUM DEPENDENT PHOSPHORYLATION TRANSCRIPTIONAL REGULATION POSTRANSCRIPTIONAL REGULATION BY MI RNAS TUBERIZATION Estudio transcripcional y post-transcripcional de la quinasa de proteínas dependiente de calcio, StCDPK1 en Solanum tuberosum y análisis de sus potenciales blancos de acción Transcriptional and post-transcriptional study of calcium-dependent protein kinase, StCDPK1 in Solanum tuberosum and analysis of its potential targets info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5755_Santin_oai

Estudio transcripcional y post-transcripcional de la quinasa de proteínas dependiente de calcio, StCDPK1 en Solanum tuberosum y análisis de sus potenciales blancos de acción

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