Estudio de mutaciones noveles como causa de la deficiencia de 21-hidroxilasa

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Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) se conoce a un conjunto deenfermedades autosómicas recesivas en las que se encuentra afectada la esteroidogénesisadrenal. En el 95% de los casos, la HSC se produce por deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa. Esta deficiencia puede manifestars...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Taboas, Melisa
Otros Autores:	Dain, Liliana
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2014
Materias:	DEFICIENCIA 21-HIDROXILASA GEN CYP21A2 MUTACIONES NOVELES ESTUDIO FUNCIONAL 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY CYP21A2 GENE NOVEL MUTATIONS FUNCTIONAL STUDIES
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5617_Taboas http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5617_Taboas_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) se conoce a un conjunto deenfermedades autosómicas recesivas en las que se encuentra afectada la esteroidogénesisadrenal. En el 95% de los casos, la HSC se produce por deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa. Esta deficiencia puede manifestarse en forma severa o clásica (FC), o leve o noclásica (FNC). La enzima está codificada por el gen CYP21A2, que se encuentra duplicado yrepetido en tándem junto a un pseudogen CYP21A1P con el que comparte 98% de identidadde secuencia. La elevada identidad de secuencia produce que la región sea propensa alalineamiento incorrecto y a la recombinación desigual, como así también a la transferencia desecuencias del pseudogen al gen mediante el mecanismo de conversión génica. La mayorparte de los afectados son compuesto heterocigotas ya que poseen diferentes mutaciones encada uno de sus alelos. En estos casos, la manifestación clínica de la enfermedad será aquellaque se relaciona con el alelo con mayor actividad enzimática. Si bien la mayor parte de lospacientes presentan mutaciones derivadas del pseudogen, hasta la fecha se identificaron másde 240 mutaciones diferentes como causales de la patología. En un trabajo previo de nuestro laboratorio se analizó la presencia de las 10 mutaciones másfrecuentes derivadas del pseudogén en pacientes con deficiencia de 21-hidoxilasa de nuestrapoblación. En esta tesis se estudió por secuenciación todo el gen CYP21A2 y su regiónpromotora en muestras de ADN de 87 pacientes (15 FC y 72 FNC) en los cuales restabadeterminar el defecto causante de la patología en uno o en ambos alelos del gen. Nuestro análisis reveló la presencia de 12 mutaciones poco frecuentes ya descriptaspreviamente y 7 mutaciones noveles, 6 en la región codificante y 1 en un sitio aceptor desplicing en el intrón 5. Para todas las mutaciones noveles halladas se analizaron 50 individuosde la población general mediante amplificación de la región de interés y cortes con enzimasde restricción y en ningún caso se halló la presencia de las mismas. Se hallaron asimismo,variantes de secuencias no descriptas previamente en regiones promotoras e intrónicas que seclasificaron como polimorfismos ya sea porque las mismas se observaron también enindividuos de la población general, o bien porque no se encuentran en sitios que a prioripudieran afectar el splicing, respectivamente.A los efectos de analizar la implicancia biológica de las mutaciones noveles halladas, serealizaron aproximaciones bioinformáticas y ensayos funcionales. Dado que la proteína CYP21A2 humana no está cristalizada, la misma se modeló mediante herramientas in silico apartir de 18 cristalografías de otras proteínas de la familia CYP. Una vez obtenido el modelo,se analizó la estabilidad de las mutantes aminoacídicas halladas que no generabancorrimiento del marco de lectura. Las predicciones indicaron cambios en la estabilidad y/ocarga de la superficie de la proteína que sugerirían un posible efecto deletéreo de las mismas. Para los ensayos funcionales, se realizaron mutagénesis dirigidas sobre un vector quecontiene al ADNc de CYP21A2, transfección en células COS-7 y estimación de la expresiónde la proteína y de su actividad mediante Western Blot y cromatografía en placa delgada (TLC), respectivamente. En todos los casos, las mutantes presentaron una actividadenzimática residual (AER) entre el 15 y el 50%, que se corresponderían con alelosrelacionados a la FNC de la patología. En uno de los pacientes, una de las mutaciones novelesse encontraba en el mismo alelo con otra descripta previamente. Los ensayos funcionalesdemostraron que si bien las mismas en forma aislada son leves, la presencia de ambas en cispredice un alelo severo con una AER cercana al 2%. Para algunas de las mutacionespuntuales y para la doble mutante se observó una disminución en la cantidad de proteínaresultante. Para la mutación en el sitio aceptor de splicing en el intrón 5, los análisis bioinformáticospredijeron la anulación del sitio canónico y la presencia de 2 sitios crípticos de splicing, unoen la mitad del intrón 5 y otro en el exón 6. Para evaluar la eficiencia de splicing in vitro, losestudios funcionales consistieron en la construcción de un minigén mediante amplificación deun fragmento entre el exón 4 y el exón 7 del gen, posterior clonado en un vector de expresión,transfección en células HeLa, HEK-293 e Y-1 y valoración del ARNm obtenido por RTPCR. Los ensayos revelaron que la mutante presentaba un ARNm más corto que la salvajeproducto de una deleción de 16 nucleótidos debido a la utilización del sitio críptico desplicing dentro del exón 6. Esta deleción generaría un codón de terminación prematuro quepredice un alelo severo relacionado con la FC de la patología. Mediante este estudio, el genotipo se completó en 27 de los 87 pacientes (100% de lospacientes FC y 16,6% FNC). Estos resultados señalarían que es probable que el valor de 17-hidroxiprogesterona (17-OHP) post estímulo con ACTH (test que se realiza para incluir a lospacientes de la FNC), esté sobreestimando la prevalencia de la patología. A los efectos de disciminar si los valores hormonales difieren entre los pacientes FNC totalmentegenotipificados y aquellos que no, se compararon los valores hormonales de 17-OHP basal ypost estimulación con ACTH, así como los de Dehidroepiandrosterona-sulfato (DHEA-S), Testosterona (T) y Androstenediona (A) de 271 pacientes diagnosticados como FNC. Losmismos fueron agrupados de acuerdo a si poseen los 2 alelos mutados, uno o ninguno. Losresultados obtenidos indican que no hay diferencias significativas entre los grupos estudiadoscuando se analizaron los valores de A, T y DHEA-S. Sin embargo, en el caso de 17-OHPbasal y post ACTH, se observan diferencias significativas entre aquellos que poseen ambosalelos con mutación y los demás grupos de estudio. Asimismo, se observó que si lospacientes presentaban valores de 17-OHP post ACTH entre 10 (valor hormonal de corte parala inclusión de pacientes) y 20 ng/ml, sólo en el 23% se hallaban los 2 alelos mutados Si elvalor hormonal era mayor a 20 ng/ml, el 85% posee ambos alelos con mutación. Por último, analizando los genotipos encontrados en todos los pacientes de nuestra cohorte,ya sea mediante secuenciación o mediante el estudio de las 10 mutaciónes más frecuentes,observamos que en un 97,7% de los pacientes el fenotipo se correspondía con el genotipohallado. Las principales discordancias se hallaron en pacientes con la mutación p.I172N, yaque la misma se asoció tanto a la forma virilizante simple (VS) como a la forma perdedora desal. Por otro lado, si bien la mutación p.R356W está altamente relacionada a la forma PS dela enfermedad, un paciente VS presentaba esta mutación en heterocigosis compuesta con otramutación que predice una enzima sin actividad en el alelo homólogo. Asimismo, en laliteratura se describe a la mutación poco frecuente p.H62L como una mutación leve yasociada a la FNC de la patología. En esta tesis, sin embargo, se refiere que la misma serelacionaría también con la forma VS de la enfermedad. Por último, la mutación pocofrecuente p.R341P se asocia a la forma VS, si bien en este trabajo se describe un paciente PSque poseía esta mutación en heterocigosis compuesta con la mutación c.283-13A/C>G en elotro alelo.
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spelling	I28-R145-tesis_n5617_Taboas_oai2023-04-26 Dain, Liliana Taboas, Melisa 2014-09-16 Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) se conoce a un conjunto deenfermedades autosómicas recesivas en las que se encuentra afectada la esteroidogénesisadrenal. En el 95% de los casos, la HSC se produce por deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa. Esta deficiencia puede manifestarse en forma severa o clásica (FC), o leve o noclásica (FNC). La enzima está codificada por el gen CYP21A2, que se encuentra duplicado yrepetido en tándem junto a un pseudogen CYP21A1P con el que comparte 98% de identidadde secuencia. La elevada identidad de secuencia produce que la región sea propensa alalineamiento incorrecto y a la recombinación desigual, como así también a la transferencia desecuencias del pseudogen al gen mediante el mecanismo de conversión génica. La mayorparte de los afectados son compuesto heterocigotas ya que poseen diferentes mutaciones encada uno de sus alelos. En estos casos, la manifestación clínica de la enfermedad será aquellaque se relaciona con el alelo con mayor actividad enzimática. Si bien la mayor parte de lospacientes presentan mutaciones derivadas del pseudogen, hasta la fecha se identificaron másde 240 mutaciones diferentes como causales de la patología. En un trabajo previo de nuestro laboratorio se analizó la presencia de las 10 mutaciones másfrecuentes derivadas del pseudogén en pacientes con deficiencia de 21-hidoxilasa de nuestrapoblación. En esta tesis se estudió por secuenciación todo el gen CYP21A2 y su regiónpromotora en muestras de ADN de 87 pacientes (15 FC y 72 FNC) en los cuales restabadeterminar el defecto causante de la patología en uno o en ambos alelos del gen. Nuestro análisis reveló la presencia de 12 mutaciones poco frecuentes ya descriptaspreviamente y 7 mutaciones noveles, 6 en la región codificante y 1 en un sitio aceptor desplicing en el intrón 5. Para todas las mutaciones noveles halladas se analizaron 50 individuosde la población general mediante amplificación de la región de interés y cortes con enzimasde restricción y en ningún caso se halló la presencia de las mismas. Se hallaron asimismo,variantes de secuencias no descriptas previamente en regiones promotoras e intrónicas que seclasificaron como polimorfismos ya sea porque las mismas se observaron también enindividuos de la población general, o bien porque no se encuentran en sitios que a prioripudieran afectar el splicing, respectivamente.A los efectos de analizar la implicancia biológica de las mutaciones noveles halladas, serealizaron aproximaciones bioinformáticas y ensayos funcionales. Dado que la proteína CYP21A2 humana no está cristalizada, la misma se modeló mediante herramientas in silico apartir de 18 cristalografías de otras proteínas de la familia CYP. Una vez obtenido el modelo,se analizó la estabilidad de las mutantes aminoacídicas halladas que no generabancorrimiento del marco de lectura. Las predicciones indicaron cambios en la estabilidad y/ocarga de la superficie de la proteína que sugerirían un posible efecto deletéreo de las mismas. Para los ensayos funcionales, se realizaron mutagénesis dirigidas sobre un vector quecontiene al ADNc de CYP21A2, transfección en células COS-7 y estimación de la expresiónde la proteína y de su actividad mediante Western Blot y cromatografía en placa delgada (TLC), respectivamente. En todos los casos, las mutantes presentaron una actividadenzimática residual (AER) entre el 15 y el 50%, que se corresponderían con alelosrelacionados a la FNC de la patología. En uno de los pacientes, una de las mutaciones novelesse encontraba en el mismo alelo con otra descripta previamente. Los ensayos funcionalesdemostraron que si bien las mismas en forma aislada son leves, la presencia de ambas en cispredice un alelo severo con una AER cercana al 2%. Para algunas de las mutacionespuntuales y para la doble mutante se observó una disminución en la cantidad de proteínaresultante. Para la mutación en el sitio aceptor de splicing en el intrón 5, los análisis bioinformáticospredijeron la anulación del sitio canónico y la presencia de 2 sitios crípticos de splicing, unoen la mitad del intrón 5 y otro en el exón 6. Para evaluar la eficiencia de splicing in vitro, losestudios funcionales consistieron en la construcción de un minigén mediante amplificación deun fragmento entre el exón 4 y el exón 7 del gen, posterior clonado en un vector de expresión,transfección en células HeLa, HEK-293 e Y-1 y valoración del ARNm obtenido por RTPCR. Los ensayos revelaron que la mutante presentaba un ARNm más corto que la salvajeproducto de una deleción de 16 nucleótidos debido a la utilización del sitio críptico desplicing dentro del exón 6. Esta deleción generaría un codón de terminación prematuro quepredice un alelo severo relacionado con la FC de la patología. Mediante este estudio, el genotipo se completó en 27 de los 87 pacientes (100% de lospacientes FC y 16,6% FNC). Estos resultados señalarían que es probable que el valor de 17-hidroxiprogesterona (17-OHP) post estímulo con ACTH (test que se realiza para incluir a lospacientes de la FNC), esté sobreestimando la prevalencia de la patología. A los efectos de disciminar si los valores hormonales difieren entre los pacientes FNC totalmentegenotipificados y aquellos que no, se compararon los valores hormonales de 17-OHP basal ypost estimulación con ACTH, así como los de Dehidroepiandrosterona-sulfato (DHEA-S), Testosterona (T) y Androstenediona (A) de 271 pacientes diagnosticados como FNC. Losmismos fueron agrupados de acuerdo a si poseen los 2 alelos mutados, uno o ninguno. Losresultados obtenidos indican que no hay diferencias significativas entre los grupos estudiadoscuando se analizaron los valores de A, T y DHEA-S. Sin embargo, en el caso de 17-OHPbasal y post ACTH, se observan diferencias significativas entre aquellos que poseen ambosalelos con mutación y los demás grupos de estudio. Asimismo, se observó que si lospacientes presentaban valores de 17-OHP post ACTH entre 10 (valor hormonal de corte parala inclusión de pacientes) y 20 ng/ml, sólo en el 23% se hallaban los 2 alelos mutados Si elvalor hormonal era mayor a 20 ng/ml, el 85% posee ambos alelos con mutación. Por último, analizando los genotipos encontrados en todos los pacientes de nuestra cohorte,ya sea mediante secuenciación o mediante el estudio de las 10 mutaciónes más frecuentes,observamos que en un 97,7% de los pacientes el fenotipo se correspondía con el genotipohallado. Las principales discordancias se hallaron en pacientes con la mutación p.I172N, yaque la misma se asoció tanto a la forma virilizante simple (VS) como a la forma perdedora desal. Por otro lado, si bien la mutación p.R356W está altamente relacionada a la forma PS dela enfermedad, un paciente VS presentaba esta mutación en heterocigosis compuesta con otramutación que predice una enzima sin actividad en el alelo homólogo. Asimismo, en laliteratura se describe a la mutación poco frecuente p.H62L como una mutación leve yasociada a la FNC de la patología. En esta tesis, sin embargo, se refiere que la misma serelacionaría también con la forma VS de la enfermedad. Por último, la mutación pocofrecuente p.R341P se asocia a la forma VS, si bien en este trabajo se describe un paciente PSque poseía esta mutación en heterocigosis compuesta con la mutación c.283-13A/C>G en elotro alelo. Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disease caused, in 95 % ofcases, by the deficiency of the 21–hydroxylase enzyme. This disorder, which is the mostfrequent inborn error of metabolism, has a broad spectrum of clinical forms, ranging fromsevere or classical, which includes the salt-wasting (SW) and simple virilising (SV) forms, tothe mild late onset or non-classical form of CAH (NCCAH). The enzyme is encoded by the CYP21A2 gene, which is duplicated and repeated in tandem along with the CYP21A1Ppseudogene with which it shares 98 % of sequence identity. The high degree of sequenceidentity makes this region prone to misalignment and unequal recombination, as well as thetransference of sequences from the pseudogene to the gene by gene conversion. Althoughmost of the patients presented pseudogene derived mutations, approximately 240 mutationshaven been described up to date. In this work, DNA from 87 patients (15 CCAH and 72 NCCAH) was analyzed by completegene sequencing. In these patients the determination of the defect causing the diseaseremained inconclusive after the study of the 10 most frequent pseudogen-derived mutations. We found 12 less frequent mutations previously described, and 7 novel ones, 6 of them in thecoding region and one in an acceptor splice site in intron 5. For all the novel mutations, DNAfrom 50 randomly selected individuals from the general population were analyzed by PCRamplification followed by restriction enzyme assays, but none of these mutations were found. We also found novel sequence variants in in the promoter region of the gene and in intronsthat were classified as polymorphisms, either because they were found in individuals from thegeneral population, or because they are placed in regions that might not affect splicingoutcome, respectively. In order to study the biological consequences of the novel mutations, bioinformaticapproaches and functional assays were performed. Since human CYP21A2 was notcrystallized yet, the protein was modeled by means of in silico tools using 18 other CYPproteins as templates followed by the estimation of the mutant protein stability. Molecularmodeling studies revealed changes in the stability and/or surface charge of the protein thatcould be related to the clinical manifestations found in the patients. For functional assays,site-directed mutagenesis of a vector containing the CYP21A2 cDNA were performed,followed by transfection into COS-7 cells and estimation of the protein expression by Western blotting (WB) and its activity by TLC. In all cases, the mutants showed a residualenzymatic activity (REA) lesser than 50% of the wild type protein. Accordingly, all thevariants predict alleles compatible to the mild NCCAH form of the disease. In one patient,one of the novel mutations was found in the same allele with another previously described. Functional assays showed that while the mutations in isolation are mild, the presence of bothmutations in cis predict a severe allele with a REA close to 2%. In the WB assays, some ofthe isolated mutants and the double one showed less amount of the protein in comparisonwith the wild type. For the novel mutation in the acceptor splcing site of intron 5, in silico analyses predicted thedisruption of the canonical site. Besides, two strong putative cryptic splicing sites, onelocated in the intron 5 and one in exon 6 were predicted. For functional assays, splicingreporter minigenes were constructed comprising the genomic region from exon 4 to exon 7of the CYP21A2 gene. The vector was transiently transfected into HEK-293, HeLa, Y-1 cellsand splicing was assessed by RT-PCR. We demonstrate that the allele with the intron 5mutation completely abolishes the use of the canonical splicing site. Instead, the use of thecryptic splicing acceptor site within exon 6 created an mRNA with a 16 nt deletion leading tothe appearance of a premature stop codon. A severe allele related to the classical form of thedisease is strongly suggested by this mutation. After our work, the genotype was completed in 27 out of 87 patients (100 % of the CCAHand 16,6% of the NCCAH). This results may indicate that the currently cut-off hormonallevels used for the diagnosis of NCCAH is overestimating the prevalence of the disease. Toevaluate if hormone values differ between the NCCAH patients fully genotyped and thosewith at least one non-determined allele, basal and post ACTH stimulation 17-hydroxyprogesterone (17-OHP), dehydroepiandrosterone-sulfate (DHEA-S), testosterone (T)and androstenedione (A) values were compared in 271 patients diagnosed as NCCAH. Patients were grouped according to whether they had 2 mutated alleles, one or no one. Ouranalysis revealed no significant differences between groups when the values of A, T and DHEA-S were compared. However, basal and post ACTH 17-OHP levels were statisticallydifferent between those patients having both mutated alleles and those with one or no one. Among patients with 17-OHP post ACTH values between 10 (currently cut-off value) and 20 ng/ml, only a 23 % had 2 mutated alleles, whereas if the values were greater than 20 ng/ml, 85 % of patients had mutations in both alleles. Finally, analyzing the genotypes found in all our patients, either after sequencing or bystudying the 10 most frequent mutations, we observed a 97,7% phenotype-genotypecorrelation, while discrepancies were found mostly associated to the p.I172N mutation. Patients having this mutation presented either with the SV form or with the SW one. Inaddition, while p.R356W mutation is strongly associated with the SW form of the disease, wefound the mutation in one patient SV with another severe mutation in the homologous allele. On the other hand, the less frequent p.H62L is described in literature related to the mild NCCAH form. In this work, however, it is reported associated to the SV form of the disease. Finally, the less frequent SV p.R341P mutation, is herein described in a SW patient havingthe c.283-13A / C> G mutation in the homologous allele. Fil: Taboas, Melisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5617_Taboas spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar DEFICIENCIA 21-HIDROXILASA GEN CYP21A2 MUTACIONES NOVELES ESTUDIO FUNCIONAL 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY CYP21A2 GENE NOVEL MUTATIONS FUNCTIONAL STUDIES Estudio de mutaciones noveles como causa de la deficiencia de 21-hidroxilasa Study of novel mutations as the cause of 21-hydroxylase deficiency info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5617_Taboas_oai

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