Aminolevúlico dehidrasa del hongo dimórfico Mucor rouxii
La 5-Aminolevúlico dehidrasa (ALA-D), segunda enzima de la biosíntesis del hemo,es una metaloenzima que cataliza la condensación de dos moléculas de ácido 5-aminolevúlico (ALA) para formar el único monopirrol natural, el Porfobilinógeno (PBG). El ALA-D en general no es la enzima limitante de la sínt...
Guardado en:
| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2013
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| Materias: | |
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AMINOLEVULICO DEHIDRASA MUCOR ROUXII DIMORFISMO BIOSINTESIS DEL HEMO ALA-D 5-AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE METAL ENZYME MUCOR ROUXII DIMORPHIC FUNGUS YEAST MYCELIUM PURIFICATION ACTIVE SITE PORPHYRIN BIOSYNTHESIS DIVALENT CATIONS REGULATORY ENZYME |
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AMINOLEVULICO DEHIDRASA MUCOR ROUXII DIMORFISMO BIOSINTESIS DEL HEMO ALA-D 5-AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE METAL ENZYME MUCOR ROUXII DIMORPHIC FUNGUS YEAST MYCELIUM PURIFICATION ACTIVE SITE PORPHYRIN BIOSYNTHESIS DIVALENT CATIONS REGULATORY ENZYME Melito, Viviana Alicia Aminolevúlico dehidrasa del hongo dimórfico Mucor rouxii |
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AMINOLEVULICO DEHIDRASA MUCOR ROUXII DIMORFISMO BIOSINTESIS DEL HEMO ALA-D 5-AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE METAL ENZYME MUCOR ROUXII DIMORPHIC FUNGUS YEAST MYCELIUM PURIFICATION ACTIVE SITE PORPHYRIN BIOSYNTHESIS DIVALENT CATIONS REGULATORY ENZYME |
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La 5-Aminolevúlico dehidrasa (ALA-D), segunda enzima de la biosíntesis del hemo,es una metaloenzima que cataliza la condensación de dos moléculas de ácido 5-aminolevúlico (ALA) para formar el único monopirrol natural, el Porfobilinógeno (PBG). El ALA-D en general no es la enzima limitante de la síntesis de hemo. En la mayoríade los organismos estudiados su actividad es muy superior a la necesaria para la formaciónde la cantidad requerida de hemo, con la excepción de Neurospora crassa y levadura,organismos en los cuales se le ha asignado un rol regulatorio. Es una enzima altamenteconservada, aún entre organismos filogenéticamente muy distantes. Sin embargo, existendiferencias en cuanto al requerimiento por metales que cumplen un papel fundamental en lacatálisis y estado de oligomerización de la proteína. La enzima de mamíferos y aves,levadura y algunas bacterias requieren Zn++. Por el contrario, la enzima de plantas y algunasbacterias requiere Mg++ en lugar de Zn++; mientras que en Rp. spheroides el requerimientopor el metal puede sustituirse por K+. Se ha propuesto que en E. coli, P. sativum y B.japonicum están presentes ambos cationes, en diferentes proporciones. Los hongos dimórficos son un grupo de organismos capaces de crecer comolevadura o micelio en respuesta a las condiciones de crecimiento; según sean estasmodificaciones pueden inducir, además, la transición morfológica de levadura a micelio oviceversa. Esta propiedad, los hace interesantes para investigar los mecanismosbioquímicos y moleculares que operan durante la diferenciación celular. En el hongodimórfico Mucor rouxii existen evidencias de que el ALA -D también cumpliría un papelregulatorio en la biosíntesis del hemo y que esta enzima, a través de la mitocondriogénesisparticiparía en la transición morfogénica de levadura a micelio. En primer lugar se determinaron las condiciones óptimas para la extracción de laproteína y medición de la actividad enzimática de ambas formas, se encontró que ésta seduplica al pasar del estado fermentativo al del micelio aeróbico. Empleando diferentes técnicas para la purificación de proteínas, como diversascolumnas de geles de afinidad, hidrofóbicos, iónicos y sulfosustituídos, se purificó la enzimade ambas formas obteniéndose preparaciones enriquecidas alrededor de 700 y 500 vecespara micelio y levadura respectivamente. En ambos casos, el peso molecular fue de 280.000 Da, coincidiendo con el determinado para el ALA-D proveniente de otras fuentes. Tanto las propiedades de estabilidad térmica como cinéticas, también resultaronsimilares para ambas formas morfogénicas del hongo, comportándose en ambos casoscomo una enzima con cinética michaeliana y valores de Km comparables. Del estudio del efecto de cationes divalentes sobre la actividad enzimática seencontró que en la enzima de Mucor rouxii, el metal involucrado es el Zn++. Se postula laexistencia de diferentes sitios de interacción del Zn++, un sitio A, en el cual el metal seencuentra fuertemente unido, un sitio B, en el que el catión se puede eliminar por diálisis yreemplazarlo parcialmente por otros cationes y sitios C, donde el Zn++ actuaría cuando laenzima se encuentre en un medio no reductor, en cuyo caso, los grupos sulfhidrilosoxidados provocarían la pérdida de la actividad catalítica, en tal situación, este catión seríacapaz de restablecer las condiciones reductoras. Se estudió además la conocida inhibiciónde la actividad del ALA-D por el Pb++. Se demostró que este metal se puede unir a todos lossitios en los que se une el Zn++, produciendo una significativa inhibición. Se sabe que los átomos de Zn++ se unen a la proteína a través de una secuenciaaltamente conservada, rica en cisteínas e histidinas. Empleándose diversos agentesbloqueantes de grupos SH se comprobó la participación de residuos cisteína que sonesenciales para la actividad enzimática y/o unión del metal; su titulación indicó la existenciade 5 grupos SH por subunidad, de los cuales 1 no se encuentra expuesto. La inhibición por DEP reveló la presencia de 2 grupos histidina por subunidad catalítica, uno de ellos esesencial para la catálisis. Cuando se modificaron algunos parámetros de las condiciones de crecimiento, seencontró que en ambas formas del Mucor rouxii el camino metabólico del hemo es funcionaly se puede inducir por el agregado de concentraciones de ALA 10Exp-5–10Exp-3 M en el medio decultivo. La captación de ALA, acumulación de precursores y porfirinas y la actividad de ALADfue significativamente mayor para micelio que para levadura. El crecimiento encondiciones aeróbicas para el micelio requiere de un mayor contenido de hemoproteínas,fundamentalmente citocromos. Esta demanda se satisface por medio del funcionamientomás activo del camino biosintético de las porfirinas en micelio que en levadura. Así, los niveles de actividad del ALA-D en levadura fueron inferiores a los del micelio. Se demostró, además, su capacidad para regular la concentración de ALA acumuladointracelularmente. Durante la transformación dimórfica inducida mediante aireación del cultivo delevadura se observó la existencia de un camino biosintético del hemo eficientementeregulado. Por lo tanto si bien la inducción de la morfogénesis desde levadura a micelioestimuló la biosíntesis de porfirinas, lo que se puso en evidencia por el aumento de actividaddel ALA-D durante la misma, no se encontró acumulación significativa ni de precursores nide porfirinas. Los resultados obtenidos permiten asignar un rol regulatorio para el ALA-D enlevadura del hongo dimórfico Mucor rouxii. |
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Batlle de Albertoni, Alcira María del Carmen |
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Batlle de Albertoni, Alcira María del Carmen Melito, Viviana Alicia |
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I28-R145-tesis_n5467_Melito_oai2023-04-26 Batlle de Albertoni, Alcira María del Carmen Melito, Viviana Alicia 2013 La 5-Aminolevúlico dehidrasa (ALA-D), segunda enzima de la biosíntesis del hemo,es una metaloenzima que cataliza la condensación de dos moléculas de ácido 5-aminolevúlico (ALA) para formar el único monopirrol natural, el Porfobilinógeno (PBG). El ALA-D en general no es la enzima limitante de la síntesis de hemo. En la mayoríade los organismos estudiados su actividad es muy superior a la necesaria para la formaciónde la cantidad requerida de hemo, con la excepción de Neurospora crassa y levadura,organismos en los cuales se le ha asignado un rol regulatorio. Es una enzima altamenteconservada, aún entre organismos filogenéticamente muy distantes. Sin embargo, existendiferencias en cuanto al requerimiento por metales que cumplen un papel fundamental en lacatálisis y estado de oligomerización de la proteína. La enzima de mamíferos y aves,levadura y algunas bacterias requieren Zn++. Por el contrario, la enzima de plantas y algunasbacterias requiere Mg++ en lugar de Zn++; mientras que en Rp. spheroides el requerimientopor el metal puede sustituirse por K+. Se ha propuesto que en E. coli, P. sativum y B.japonicum están presentes ambos cationes, en diferentes proporciones. Los hongos dimórficos son un grupo de organismos capaces de crecer comolevadura o micelio en respuesta a las condiciones de crecimiento; según sean estasmodificaciones pueden inducir, además, la transición morfológica de levadura a micelio oviceversa. Esta propiedad, los hace interesantes para investigar los mecanismosbioquímicos y moleculares que operan durante la diferenciación celular. En el hongodimórfico Mucor rouxii existen evidencias de que el ALA -D también cumpliría un papelregulatorio en la biosíntesis del hemo y que esta enzima, a través de la mitocondriogénesisparticiparía en la transición morfogénica de levadura a micelio. En primer lugar se determinaron las condiciones óptimas para la extracción de laproteína y medición de la actividad enzimática de ambas formas, se encontró que ésta seduplica al pasar del estado fermentativo al del micelio aeróbico. Empleando diferentes técnicas para la purificación de proteínas, como diversascolumnas de geles de afinidad, hidrofóbicos, iónicos y sulfosustituídos, se purificó la enzimade ambas formas obteniéndose preparaciones enriquecidas alrededor de 700 y 500 vecespara micelio y levadura respectivamente. En ambos casos, el peso molecular fue de 280.000 Da, coincidiendo con el determinado para el ALA-D proveniente de otras fuentes. Tanto las propiedades de estabilidad térmica como cinéticas, también resultaronsimilares para ambas formas morfogénicas del hongo, comportándose en ambos casoscomo una enzima con cinética michaeliana y valores de Km comparables. Del estudio del efecto de cationes divalentes sobre la actividad enzimática seencontró que en la enzima de Mucor rouxii, el metal involucrado es el Zn++. Se postula laexistencia de diferentes sitios de interacción del Zn++, un sitio A, en el cual el metal seencuentra fuertemente unido, un sitio B, en el que el catión se puede eliminar por diálisis yreemplazarlo parcialmente por otros cationes y sitios C, donde el Zn++ actuaría cuando laenzima se encuentre en un medio no reductor, en cuyo caso, los grupos sulfhidrilosoxidados provocarían la pérdida de la actividad catalítica, en tal situación, este catión seríacapaz de restablecer las condiciones reductoras. Se estudió además la conocida inhibiciónde la actividad del ALA-D por el Pb++. Se demostró que este metal se puede unir a todos lossitios en los que se une el Zn++, produciendo una significativa inhibición. Se sabe que los átomos de Zn++ se unen a la proteína a través de una secuenciaaltamente conservada, rica en cisteínas e histidinas. Empleándose diversos agentesbloqueantes de grupos SH se comprobó la participación de residuos cisteína que sonesenciales para la actividad enzimática y/o unión del metal; su titulación indicó la existenciade 5 grupos SH por subunidad, de los cuales 1 no se encuentra expuesto. La inhibición por DEP reveló la presencia de 2 grupos histidina por subunidad catalítica, uno de ellos esesencial para la catálisis. Cuando se modificaron algunos parámetros de las condiciones de crecimiento, seencontró que en ambas formas del Mucor rouxii el camino metabólico del hemo es funcionaly se puede inducir por el agregado de concentraciones de ALA 10Exp-5–10Exp-3 M en el medio decultivo. La captación de ALA, acumulación de precursores y porfirinas y la actividad de ALADfue significativamente mayor para micelio que para levadura. El crecimiento encondiciones aeróbicas para el micelio requiere de un mayor contenido de hemoproteínas,fundamentalmente citocromos. Esta demanda se satisface por medio del funcionamientomás activo del camino biosintético de las porfirinas en micelio que en levadura. Así, los niveles de actividad del ALA-D en levadura fueron inferiores a los del micelio. Se demostró, además, su capacidad para regular la concentración de ALA acumuladointracelularmente. Durante la transformación dimórfica inducida mediante aireación del cultivo delevadura se observó la existencia de un camino biosintético del hemo eficientementeregulado. Por lo tanto si bien la inducción de la morfogénesis desde levadura a micelioestimuló la biosíntesis de porfirinas, lo que se puso en evidencia por el aumento de actividaddel ALA-D durante la misma, no se encontró acumulación significativa ni de precursores nide porfirinas. Los resultados obtenidos permiten asignar un rol regulatorio para el ALA-D enlevadura del hongo dimórfico Mucor rouxii. 5-Aminolevulinic Acid Dehydratase (ALA-D) is a metal enzyme, the second in thehaem biosynthetic pathway, which catalices the condensation of two molecules of 5- Aminolevulinic Acid (ALA) to yield the monopyrrol Porphobilinogen. In general, ALA-D is not the regulating enzyme in haem biosynthesis. In mostorganisms, its activity is high in accordance with the cells needs of haem, excepting in Neurospora crassa and yeasts, where a regulatory role has been assigned. It is an enzymehighly preserved. However there exist differences about its requirements for metals, whichplay a key role in both the catalysis and oligomeritation of ALA-D. In mammals, birds, fowls,yeasts and some bacteria, the enzyme requires Zn++. . Instead, the ALA-D from plants andsome bacteria requires Mg++ and not Zn++., while in Rp. spheroides, the metal can bereplaced for K+. It has been indicated that in E. coli, P. salivum and B. japonicum, can bepresent both cations, in different proportions. The dimorphic fungus are a group of organisms, which depending on the growingconditions, are able of developing both as yeasts and mycelium. Manipulation of suchconditions can induce the morphological transition from yeasts to mycelium and vice versa. In the dimorphic fungus Mucor rouxii, there is evidence that the ALA-D would play aregulatory role in haem biosynthesis and that it also would participate in the morphogenictransition from yeasts to mycelium. The optimum conditions for extracting the protein and measuring enzymic activity,from both forms were determined, it was found that activity is doubled when passing fromthe fermentative state to the aerobical mycelium form. Using several affinity chromatography columns, hydrophobics, ionics and sulphosubstituted, the enzyme from yeasts and mycelium was purified 500 and 700 times,respectively. The molecular weight was also 280,000 Da for both forms. Thermal stability and kinetics was again similar for yeasts and mycelium, showing amichaelianan kinetics and comparable Km values. The action of divalent cations on the enzymic activity showed that in Mucor rouxii, themetal involved is Zn++. The existence of different interaction sites for Zn++, has beenproposed, an A site, where Zn++.is tightly attached, a B site where the metal can be removedby dialysis and be partially replaced for other cations and a C site, where Zn++ would functionwhen the enzyme is found in a non reducing media, in this case, the oxidized sulphydrilgroups would diminish the catalytic activity, in such a situation, Zn++ could restore thereducing conditions. It is well known the strong inhibition of ALA-D by Pb++. It wasdemonstrated, that this metal can be attached to all Zn++ sites, significantly reducing theenzyme activity. The Zn++ atoms, bind to the protein trough a sequence highly preserved, rich incysteins and histidines. Using several blockers of SH groups the participation of cysteinresidues essentials for activity and/or metal binding was shown, by tritation 5 SH residuesper subunit were measured, one of them not exposed. Inhibition by DEP revealed thepresence of 2 histidines per subunit, only one of them necessary for catalysis. Some parameters of growing conditions were modified, showing, that in both forms of Mucor rouxii, the haem pathway is functional and it can even be induced by adding ALA 10Exp-5 - 10Exp-3 M to the culture medium. Incorporation of ALA, accumulation of precursors and porphyrins and ALA-D activitywas significantly higher in mycelium than in yeasts, in concordance with a haem synthesisnecessarily greater in the former. The levels of ALA-D activity in yeasts were then lower than in mycelium. It wasdemonstrated the capacity of yeasts to regulate the concentration of ALA intracellularlyaccumulated. Along the dimorphic transition induced through aereation of yeasts cultures, it wasobserved that this process stimulates porphyrin biosynthesis, shown by an increase in theactivity of mycelium ALA-D, although accumulation of neither precursors nor porphyrins wasdetected. These findings allow us to assign a regulatory role for the yeasts ALA-D of Mucorrouxii. Fil: Melito, Viviana Alicia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5467_Melito spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar AMINOLEVULICO DEHIDRASA MUCOR ROUXII DIMORFISMO BIOSINTESIS DEL HEMO ALA-D 5-AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE METAL ENZYME MUCOR ROUXII DIMORPHIC FUNGUS YEAST MYCELIUM PURIFICATION ACTIVE SITE PORPHYRIN BIOSYNTHESIS DIVALENT CATIONS REGULATORY ENZYME Aminolevúlico dehidrasa del hongo dimórfico Mucor rouxii Aminolevulinic acid dehydratase from the dimorphic fungus Mucor rouxii info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5467_Melito_oai |