Estudio de la expresión del gen CISD1 mediada por la actividad del CFTR

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La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesivaproducida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Muy poco se sabe sobre los mecanismos moleculares involucrados en el dañocelular producido por la falla del canal CFTR. Mediante la metodología de “Display Diferen...

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Autor principal:	Taminelli, Guillermo Luis
Otros Autores:	Santa Coloma, Tomás A.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2010
Materias:	FIBROSIS QUISTICA CFTR CISD1 MITOCONDRIA COMPLEJO I MITOCONDRIAL CYSTIC FIBROSIS MITOCHONDRIA MITOCHONDRIAL COMPLEX I
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4788_Taminelli http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4788_Taminelli_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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Para ello se utilizaron técnicas como RT-PCR semi cuantitativas y RT seguidade PCR en tiempo real para medir los niveles de expresión de CISD1 endistintos modelos celulares de FQ o con células que expresasen CFTR wt enpresencia de inhibidores o activadores del CFTR. Ya que CISD1 es un genque se encuentra en el genoma nuclear, el siguiente enfoque de esta Tesis fuedeterminar la localización subcelular de su producto. En este caso, se utilizó laexpresión de una quimera unida a EGFP y mediante microscopía confocalpudimos demostrar que CISD1 codifica una proteína de localizaciónmitocondrial. La localización mitocondrial fue confirmada por Wiley y col. Ellosademás reportaron que CISD1 posee un grupo prostético del tipo 2Fe-2S enlugar de Zinc, como postulamos en un principio debido a su estructura primaria. La función de esta proteína es desconocida, pero estudios hechos enmitocondrias aisladas de células cardíacas de un ratón nulo (-/-) paramitoNEET (CISD1 en humanos) presentaban disminuída en un 30 % lacapacidad máxima de la fosforilación oxidativa medida en estado 3. Además,en un trabajo anterior de Colca y colaboradores, se reportó que la proteína Minner-1 de ratón (producto de splicing alternativo de CISD1) co-inmuno precipitó con proteínas pertenecientes al complejo l de la cadena de transportede electrones. Luego de que comprobamos su localización mitocondrial mediante laquimera GFP-CISD1, nuestro siguiente objetivo fue determinar si la actividaddel complejo I mitocondrial se encontraba afectada por la expresión diferencialde CISD1 (un efecto observado en FQ por Grabriel Valdivieso en su Tesis, aúnno publicado). Para tal fin medimos la actividad in gel del CIm mediante latécnica “Blue Native-PAGE” (BN-PAGE), en mitocondrias extraídas desdediferentes modelos experimentales de células FQ transfectadas con CISD1salvaje y células Caco-2 (no FQ) transfectadas con un variante mutada de CISD1 obtenida por mutagénesis dirigida en las cisteínas 72 y 74 que fueronreemplazadas por serinas en un plásmido de expresión para eucariotas pcDNA 3.1(-). Así, observamos que la disminución significativa de la actividad del CImreportada por Valdivieso y col. en distintos modelos FQ era restaurada por laexpresión ectópica de CISD1, mientras que la variante mutada de CISD1moduló negativamente la actividad normal del Clm en células Caco-2 (no FQ). Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused bymutations in the gene encoding the CFTR chloride channel. Very little is knownabout the molecular mechanisms involved in the disease. Using themethodology of "Differential Display" (DD), we observed that the expression ofthe nuclear gene CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) was decreased in a cellmodel of CF. Since DD is a technique that might provide false positive ornegative results, the results has to be validated by using other methods. Thus,the first objetive of this Thesis was to corroborate the DD results. For thispurpose, we used semi-quantitative RT-PCR and RT followed by real-time PCRto measure the expression levels of CISD1 in different CF cell models. We alsoused non-CF cells in presence of CFTR inhibitors or activators. Since CISD1 isa gene found in the nuclear genome, the following focus of this thesis was todetermine the subcellular location of the CISD1 product. We used theexpression of a chimera containing CISD1 linked to EGFP and by usingconfocal microscopy we could show that CISD1 indeed encodes for a protein ofmitochondrial localization, as the program PSORT previosuly predicted. Themitochondrial location was also confirmed by Wiley et al. They reported that CISD1 has a 2Fe-2S type prosthetic group instead of zinc as we originallythought. The function of this protein is unknown yet, but studies done inisolated mitochondria of cardiac cells from a null (-/-) mouse for mitoNEET (CISD1 in humans) had decreased by 30% the maximal capacity of oxidativephosphorylation measured in state 3. Furthermore, in a previous work, Colca etal. reported that the mouse protein Minner-1 co-immune precipitated withproteins belonging to the mCl of the electron transport chain (ETC). We alsoshowed previously (Valdivieso et al), that the mitochondrial protein ND4, whichbelong to the mitocondrial complex I, was reducen in FQ. Therefore, our nextgoal was to determine whether mitochondrial complex I activity was affected bythe differential expression of CISD1. To this end, we measured the in gel mClactivity using the "Blue Native-PAGE (BN-PAGE) technique, in mitochondria extracted from different experimental models of CF cells, transfected with CISD1 wt, and non- CF cells transfected with a mutated variant of CISD1. Weobserved that the significant decrease in the mCl activity reported by Valdiviesoet al. in different CF models, can be partially restored by the CISD1 ectopicexpression, while the mutated variant of CISD1 down modulated the normalmCl activity in non-CF Caco-2 cells. Fil: Taminelli, Guillermo Luis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4788_Taminelli spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar FIBROSIS QUISTICA CFTR CISD1 MITOCONDRIA COMPLEJO I MITOCONDRIAL CYSTIC FIBROSIS CFTR CISD1 MITOCHONDRIA MITOCHONDRIAL COMPLEX I Estudio de la expresión del gen CISD1 mediada por la actividad del CFTR Study of gene expression mediated CISD1 CFTR activity info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4788_Taminelli_oai

Estudio de la expresión del gen CISD1 mediada por la actividad del CFTR

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