Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?

Mostrar todas las versiones(3)

La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el...

Descripción completa

Guardado en:

Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Sarnacki, Sebastián Hernán
Otros Autores:	Cerquetti, M. Cristina
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2010
Materias:	SALMONELLA ENTERICA MUTANTES DAM RESPUESTA INFLAMATORIA SISTEMA DE SECRECION TIPO TRES LIPOPOLISACÁRIDO DAM MUTANT INFLAMMATORY RESPONSE TYPE THREE SECRETION SYSTEM LIPOPOLYSACCHARIDE
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4625_Sarnacki http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4625_Sarnacki_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

id	I28-R145-tesis_n4625_Sarnacki_oai
record_format	dspace
institution	Universidad de Buenos Aires
institution_str	I-28
repository_str	R-145
collection	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA)
language	Español
orig_language_str_mv	spa
topic	SALMONELLA ENTERICA MUTANTES DAM RESPUESTA INFLAMATORIA SISTEMA DE SECRECION TIPO TRES LIPOPOLISACÁRIDO SALMONELLA ENTERICA DAM MUTANT INFLAMMATORY RESPONSE TYPE THREE SECRETION SYSTEM LIPOPOLYSACCHARIDE
spellingShingle	SALMONELLA ENTERICA MUTANTES DAM RESPUESTA INFLAMATORIA SISTEMA DE SECRECION TIPO TRES LIPOPOLISACÁRIDO SALMONELLA ENTERICA DAM MUTANT INFLAMMATORY RESPONSE TYPE THREE SECRETION SYSTEM LIPOPOLYSACCHARIDE Sarnacki, Sebastián Hernán Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?
topic_facet	SALMONELLA ENTERICA MUTANTES DAM RESPUESTA INFLAMATORIA SISTEMA DE SECRECION TIPO TRES LIPOPOLISACÁRIDO SALMONELLA ENTERICA DAM MUTANT INFLAMMATORY RESPONSE TYPE THREE SECRETION SYSTEM LIPOPOLYSACCHARIDE
description	La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente.
author2	Cerquetti, M. Cristina
author_facet	Cerquetti, M. Cristina Sarnacki, Sebastián Hernán
format	Tesis doctoral Tesis doctoral publishedVersion
author	Sarnacki, Sebastián Hernán
author_sort	Sarnacki, Sebastián Hernán
title	Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?
title_short	Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?
title_full	Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?
title_fullStr	Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?
title_full_unstemmed	Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?
title_sort	mutantes de salmonella enterica en el gen de adn adenina metil transferasa (dam). ¿cepas ideales para la construccion de vacunas?
publisher	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
publishDate	2010
url	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4625_Sarnacki http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4625_Sarnacki_oai
work_keys_str_mv	AT sarnackisebastianhernan mutantesdesalmonellaentericaenelgendeadnadeninametiltransferasadamcepasidealesparalaconstrucciondevacunas AT sarnackisebastianhernan salmonellaentericadnaadeninemethyltransferasemutantidealstrainsforvaccinedevelopment
_version_	1766015670015754240
spelling	I28-R145-tesis_n4625_Sarnacki_oai2023-04-26 Cerquetti, M. Cristina Sarnacki, Sebastián Hernán 2010 La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente. DNA adenine methyltransferase (Dam) enzyme is a global regulator of bacterial gene expression. In previous studies, Salmonella Typhimurium dam mutants have been proposed as excellent vaccines strains because of their characteristic of attenuation and protective capabilities. By extension, dam gene mutation has been proposed as a method for attenuating a variety of bacterial species. Given our interest in the study and prevention of infections with Salmonella Enteritidis, a serotype that most commonly causes enterocolitis in humans, we generate S. Enteritidis dam mutants by transposition and site-directed mutagenesis by replacement. Interestingly, studies in Balb/c mice showed that the S. Enteritidis dam mutants, are only moderate in their attenuation. Thirty percent (30%) of animals inoculated by the intragastric route with the mutant died within 3 weeks. Moreover, the protection of immunized animals challenge with the virulent strain of Salmonella Enteritidis # 5694, did not reach acceptable levels. Given the critical role that macrophages play in innate immunity against Salmonella, we analyzed the interaction between SEΔdam mutant and macrophage cell line RAW 264.7. By Western blot, we found that the expression of inflammatory molecules in macrophages infected with SEΔdam is attenuated. As activation of the inflammatory response of macrophages is generated in part by bacterial antigens, we wondered whether the lack of Dam might be affecting the structure or function of certain effector proteins or lipopolysaccharide (LPS) of Salmonella Enteritidis. Therefore, we studied the involvement of Dam on protein synthesis and secretion of two effector proteins both dependent on type 3 secretion systems. To this purpose, we constructed and characterized Salmonella dam mutants carrying sopA and sopB genes tagged with the FLAG epitope. The results showed that the dam mutant has a reduced expression and secretion of SopA and SopB invasion proteins, which are Salmonella pathogenicity island (SPI-1)-dependent. This finding indicates that Dam methylation is involved in the regulation of the synthesis and secretion of SopA and SopB proteins in Salmonella as an upregulator of these genes. We also investigated the involvement of the Dam enzyme in S. Enteritidis LPS synthesis. We found that compared to the parental strain, a SEΔdam mutant synthesized LPS with shorter O-antigen polysaccharide chain lengths. Since Wzz is responsible for the chain length distribution of O-antigen, we investigated whether Dam methylation is involved in regulating wzz gene expression. Densitometric analysis of Western blot with samples of protein extracts showed that the relative amount of Wzz protein produced by SEΔdam is three-fold lower than that of the parental strain. Concomitantly, wzz gene promoter activity in SEΔdam was reduced, as measured by chromosomal transcriptional fusion with a reporter gene, and this result was further confirmed by the amount of mRNA as measured by RT-PCR quantitative real-time analysis. Also, the expression of pmrA and rcsB genes (two wzz gene regulators) in the dam mutant was reduced. However, the defect in the chain length distribution of O-antigen of the SEΔdam, was associated only with RcsB. Our results show that Dam methylation regulates the LPS synthesis of Salmonella. Overall, these results indicate that Dam methylation in Salmonella regulates functions related intimately to the host-bacteria interaction. Therefore, the dam gene deletion as a method of attenuation of vaccine strains must be analyzed critically. Fil: Sarnacki, Sebastián Hernán. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4625_Sarnacki spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar SALMONELLA ENTERICA MUTANTES DAM RESPUESTA INFLAMATORIA SISTEMA DE SECRECION TIPO TRES LIPOPOLISACÁRIDO SALMONELLA ENTERICA DAM MUTANT INFLAMMATORY RESPONSE TYPE THREE SECRETION SYSTEM LIPOPOLYSACCHARIDE Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas? Salmonella enterica DNA adenine methyltransferase mutant: ideal strains for vaccine development? info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4625_Sarnacki_oai

Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?

Ejemplares similares