Genomica funcional de transportadores de aminoacidos y poliaminas de Trypanosoma cruzi

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El trabajo en el que se basa esta tesis representa un aporte al conocimiento de nuevos elementos del metabolismo del parásito Trypanosoma cruzi. En particular, describe genes encargados de transportar metabolitos esenciales para este organismo. Pero, más que nada, es un aporte para una futura sistem...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Canepa, Gaspar Exequiel
Otros Autores:	Pereira, Claudio A.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2010
Materias:	ENFERMEDAD DE CHAGAS TRYPANOSOMA CRUZI TRANSPORTE DE AMINOACIDOS EXPRESION DE TRANSPORTADORES TCAAAP CHAGAS DISEASE AMINOACID TRANSPORT TRANSPORTERS EXPRESSION
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4594_Canepa http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4594_Canepa_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	El trabajo en el que se basa esta tesis representa un aporte al conocimiento de nuevos elementos del metabolismo del parásito Trypanosoma cruzi. En particular, describe genes encargados de transportar metabolitos esenciales para este organismo. Pero, más que nada, es un aporte para una futura sistematización en el estudio de moléculas transportadoras. Acerca del organismo estudiado podemos describir al Trypanosoma cruzi como el agente causal de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica en Argentina y en toda América Latina. Este parásito presenta numerosas características metabólicas diferenciales respecto a sus hospedadores insectos y mamíferos, siendo incapaz de sintetizar numerosos componentes celulares. Sin embargo, esta incapacidad metabólica es compensada mediante sistemas transportadores de múltiples metabolitos desde el hospedador. Luego de la reciente secuenciación del genoma de T.cruzi, se estima que existen al menos 374 genes que codifican para distintos transportadores distribuidos en tres grupos principales: canales iónicos, transportadores dependientes de ATP y transportadores secundarios. En este trabajo se estudio con énfasis a la familia de transportadores de aminoácidos denominada AAAP (Amino Acid Auxin Permease) de T. cruzi (TcAAAP). El estudio bioinformático de esta familia demostró que todos sus miembros poseen diferencias en sus extremos amino terminales pero tienen un alto nivel de identidad en el resto de sus secuencias, llegando hasta el 75% de similitud. Luego de evaluar diferentes estrategias para la correcta expresión heteróloga de estas moléculas, se encontraron exitosas las llevadas a cabos en ovocitos de Xenopus laevis y células de Saccharomyces cerevisiae. El modelo de ovocitos de Xenopus permitió identificar y caracterizar a un transportador con afinidad para la poliamina espermidina, la cual T. cruzi es incapaz de sintetizar de novo. En cuanto al estudio en diferentes modelos de levaduras, se logró expresar funcionalmente tres transportadores específicos para los aminoácidos prolina, arginina y lisina. En el caso de los dos primeros, estos pudieron ser caracterizados desde el punto de vista molecular y relacionados con datos bioquímicos previos, que integran el transporte de estos aminoácidos con el metabolismo energético del parásito. Finalmente, la permeasa de lisina fue extensamente estudiada. Se realizó una caracterización bioquímica del transporte de este aminoácido en epimastigotes en cultivo y se produjeron numerosas construcciones para su manipulación génica. Esta metodología se utilizó para comprobar la actividad y especificidad de la permeasa, además de su localización subcelular en el bolsillo flagelar, donde, probablemente, ocurre el ingreso de diversos metabolitos a la célula a través de transportadores. Por lo tanto y como se mencionó anteriormente, en este trabajo se identificaron y estudiaron por primera vez moléculas involucradas en el transporte de aminoácidos y poliaminas en Trypanosoma cruzi, nutrientes esenciales para la vida de este parásito.
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Luego de la reciente secuenciación del genoma de T.cruzi, se estima que existen al menos 374 genes que codifican para distintos transportadores distribuidos en tres grupos principales: canales iónicos, transportadores dependientes de ATP y transportadores secundarios. En este trabajo se estudio con énfasis a la familia de transportadores de aminoácidos denominada AAAP (Amino Acid Auxin Permease) de T. cruzi (TcAAAP). El estudio bioinformático de esta familia demostró que todos sus miembros poseen diferencias en sus extremos amino terminales pero tienen un alto nivel de identidad en el resto de sus secuencias, llegando hasta el 75% de similitud. Luego de evaluar diferentes estrategias para la correcta expresión heteróloga de estas moléculas, se encontraron exitosas las llevadas a cabos en ovocitos de Xenopus laevis y células de Saccharomyces cerevisiae. El modelo de ovocitos de Xenopus permitió identificar y caracterizar a un transportador con afinidad para la poliamina espermidina, la cual T. cruzi es incapaz de sintetizar de novo. En cuanto al estudio en diferentes modelos de levaduras, se logró expresar funcionalmente tres transportadores específicos para los aminoácidos prolina, arginina y lisina. En el caso de los dos primeros, estos pudieron ser caracterizados desde el punto de vista molecular y relacionados con datos bioquímicos previos, que integran el transporte de estos aminoácidos con el metabolismo energético del parásito. Finalmente, la permeasa de lisina fue extensamente estudiada. Se realizó una caracterización bioquímica del transporte de este aminoácido en epimastigotes en cultivo y se produjeron numerosas construcciones para su manipulación génica. Esta metodología se utilizó para comprobar la actividad y especificidad de la permeasa, además de su localización subcelular en el bolsillo flagelar, donde, probablemente, ocurre el ingreso de diversos metabolitos a la célula a través de transportadores. Por lo tanto y como se mencionó anteriormente, en este trabajo se identificaron y estudiaron por primera vez moléculas involucradas en el transporte de aminoácidos y poliaminas en Trypanosoma cruzi, nutrientes esenciales para la vida de este parásito. The work in behind this thesis represents a contribution to knowledge of new features of the metabolism of the parasite Trypanosoma cruzi. In particular, it describes genes responsible for transporting essential metabolites for this organism. But more than anything is a contribution for future systematization in the study of carrier molecules. About the studied organism Trypanosoma cruzi, it can be described as the ethiological agent of Chagas disease, endemic in Argentina and throughout Latin America. This parasite has many differential metabolic characteristics with respect to their vector insects and host mammals, being unable to synthesize many cell components. However, this metabolic inability is compensated by multiple conveyor systems of metabolites from the host. Following recent sequenciation of the T. cruzi genome, it is estimated that there are at least 374 different genes that encode transporters distributed in three main groups: ion channels, ATP-dependent and secondary transporters. In this study we focus on the amino acid transporter family called AAAP (Amino Acid Auxin permease) of T. cruzi (TcAAAP). The bioinformatic study of this family showed that all members have differences in their amino terminal but have a high level of identity in the rest of the sequences, reaching 75% of similarity. After evaluating different strategies for the successful heterologous expression of these molecules, we found that the best ones were those carried on Xenopus laevis oocytes and Saccharomyces cerevisiae cells. The model of Xenopus oocytes allowed the identification and characterization of a transporter with affinity for the polyamine spermidine, which T. cruzi is unable to synthesize de novo. Regarding the study on different models of yeast, functional expression was achieved with three transporters specific for the amino acids proline, arginine and lysine. For the first two, they could be characterized molecularly and biochemically, findings that could be related to prior data, which includes the link between transport of these amino acids to energy metabolism of the parasite. Finally, the lysine permease was extensively studied. We performed a biochemical characterization of this amino acid transport in T. cruzi epimastigotes cultures and there were produced numerous constructs in order to manipulate its gene. This methodology was used to test the activity and specificity of the permease, in addition to its subcellular localization in the flagellar pocket, where, presumably, occurs the entry of various metabolites into the cell through transporters. Therefore, and as mentioned above, in this work were identified and first studied, molecules involved in the transport of amino acids and polyamines in Trypanosoma cruzi, nutrients essential for the life of this parasite. Fil: Canepa, Gaspar Exequiel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4594_Canepa spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar ENFERMEDAD DE CHAGAS TRYPANOSOMA CRUZI TRANSPORTE DE AMINOACIDOS EXPRESION DE TRANSPORTADORES TCAAAP CHAGAS DISEASE TRYPANOSOMA CRUZI AMINOACID TRANSPORT TRANSPORTERS EXPRESSION TCAAAP Genomica funcional de transportadores de aminoacidos y poliaminas de Trypanosoma cruzi Functional genomics of amino acids and polyamines transporters of Trypanosoma cruzi info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4594_Canepa_oai

Genomica funcional de transportadores de aminoacidos y poliaminas de Trypanosoma cruzi

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