Estudio del efecto del factor de Necrosis tumoral -alfa sobre las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra en relación a la enfermedad de Parkinson

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La enfermedad de Parkinson (PD, “Parkinson Disease”) es una enfermedad neurodegenerativacrónica, de desarrollo muy lento. Su característica neuropatológica sobresaliente es la pérdida de lasneuronas dopaminérgicas de la substantía nigra (s.n.) del cerebro. No se conoce la causa cierta, niexiste una...

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Autor principal: Di Paolo, Nelson César
Otros Autores: Pitossi, Fernando
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2002
Materias:
ENFERMEDAD DE PARKINSON
TNF-ALFA
NEURODEGENERACION
NEUROPROTECCION
PARKINSON DISEASE
NEURODEGENERATION
NEUROPROTECTION
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3466_DiPaolo
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3466_DiPaolo_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La enfermedad de Parkinson (PD, “Parkinson Disease”) es una enfermedad neurodegenerativacrónica, de desarrollo muy lento. Su característica neuropatológica sobresaliente es la pérdida de lasneuronas dopaminérgicas de la substantía nigra (s.n.) del cerebro. No se conoce la causa cierta, niexiste una cura para esta enfermedad. Las citoquinas inflamatorias han sido halladas en el cerebro de pacientes con diversasenfermedades neurodegenerativas, inclusive con PD. El Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF) esuna citoquina de particular interés, porque puede inducir tanto la sobrevida como la muerte deneuronas. El TNF y sus receptores han sido detectados en la s.n. de pacientes con PD, pero no depersonas sanas. Sin embargo, no se tiene ninguna evidencia de cual podría ser la función del mismoen dicha patología. Utilizando ratones knock-in “hipomórficos” y un promotor específico de la s.n. (engrailed), selogró la expresión constitutiva de TNF en la s.n. de ratones. Combinando lo previo con doselementos más (vectores adenovirales y el sistema Cre-LoxP), se desarrolló un modelo para lograr laexpresión crónica de diferentes niveles de TNF en el cerebro de ratones in vivo. El mismo fueutilizado para analizar el papel de esa citoquina en la sobrevida o muerte de las neuronasdopaminérgicas. Realizando una única inyección estereotáxica de vectores adenovirales (Ad), se logrótransducir las neuronas dopaminérgicas de la s.n. del ratón casi en un 100%. Así, cuando animalesknock-in fueron inoculados en la s.n. con un adenovector codificante para la recombinasa Cre (AdCre), se observó la recombinación y escisión de un cassette que interfería con la expresión deltransgén (cassette “PGK-neo”). El mismo estaba flanqueado por sitios llamados Lox-P (“floxeado”),los cuales son reconocidos por la recombinasa Cre. Seguidamente se demostró un aumentoespecífico en la expresión del TNF respecto del basal en la s.n. de los animales knock-in inyectadoscon el AdCre, pero no cuando fueron inyectados con un Angal, o en animales silvestres (wt)inyectados con cualquiera de los dos adenovectores. Esos resultados demostraron que el mencionadocassette PGK-neo ejerce un efecto de “interferencia transcripcional” sobre el transgen de interés. Así, la combinación de las estrategias mencionadas ha permitido lograr la expresión constitutiva, einducida, de una proteína de interés (TNF) en la s.n. del ratón. El análisis funcional de estos animales reveló que el TNF crónico inducido en algún momentode la vida adulta del animal provoca la lenta y progresiva desaparición de las neuronasdopaminérgicas de la s.n., representando un nuevo modelo de PD. Por otro lado, fue muy interesante observar que la expresión constitutiva de TNF logróaumentar 3 veces más el número de neuronas sobrevivientes que en los grupos controles ante eltratamiento de los animales con 6-hidroxidopamina (6-OHDa), una droga utilizada para modelar la PD. Estos resultados son un indicio para comenzar a comprender datos previos contradictorios de laliteratura, referidos a la muerte o protección de neuronas mediado por TNF (el efecto final en cadacaso podría depender de la concentración). La información aquí presentada será útil al considerar la posibilidad de una terapia que dealguna manera u otra afecte al TNF, o a cualquier otra citoquina (anti-inflamatorios, por ejemplo),como se ha realizado recientemente para esclerosis múltiple. Finalmente, la estrategia utilizada permitirá el estudio de las funciones de proteínas expresadasen la s.n. en forma controlada, y abre la posibilidad de establecer nuevos modelos animales de PD. Aún más, utilizando otros promotores endógenos, podrá permitir el estudio de otras patologíascrónicas en el cerebro.
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spelling I28-R145-tesis_n3466_DiPaolo_oai2023-04-26 Pitossi, Fernando Di Paolo, Nelson César 2002 La enfermedad de Parkinson (PD, “Parkinson Disease”) es una enfermedad neurodegenerativacrónica, de desarrollo muy lento. Su característica neuropatológica sobresaliente es la pérdida de lasneuronas dopaminérgicas de la substantía nigra (s.n.) del cerebro. No se conoce la causa cierta, niexiste una cura para esta enfermedad. Las citoquinas inflamatorias han sido halladas en el cerebro de pacientes con diversasenfermedades neurodegenerativas, inclusive con PD. El Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF) esuna citoquina de particular interés, porque puede inducir tanto la sobrevida como la muerte deneuronas. El TNF y sus receptores han sido detectados en la s.n. de pacientes con PD, pero no depersonas sanas. Sin embargo, no se tiene ninguna evidencia de cual podría ser la función del mismoen dicha patología. Utilizando ratones knock-in “hipomórficos” y un promotor específico de la s.n. (engrailed), selogró la expresión constitutiva de TNF en la s.n. de ratones. Combinando lo previo con doselementos más (vectores adenovirales y el sistema Cre-LoxP), se desarrolló un modelo para lograr laexpresión crónica de diferentes niveles de TNF en el cerebro de ratones in vivo. El mismo fueutilizado para analizar el papel de esa citoquina en la sobrevida o muerte de las neuronasdopaminérgicas. Realizando una única inyección estereotáxica de vectores adenovirales (Ad), se logrótransducir las neuronas dopaminérgicas de la s.n. del ratón casi en un 100%. Así, cuando animalesknock-in fueron inoculados en la s.n. con un adenovector codificante para la recombinasa Cre (AdCre), se observó la recombinación y escisión de un cassette que interfería con la expresión deltransgén (cassette “PGK-neo”). El mismo estaba flanqueado por sitios llamados Lox-P (“floxeado”),los cuales son reconocidos por la recombinasa Cre. Seguidamente se demostró un aumentoespecífico en la expresión del TNF respecto del basal en la s.n. de los animales knock-in inyectadoscon el AdCre, pero no cuando fueron inyectados con un Angal, o en animales silvestres (wt)inyectados con cualquiera de los dos adenovectores. Esos resultados demostraron que el mencionadocassette PGK-neo ejerce un efecto de “interferencia transcripcional” sobre el transgen de interés. Así, la combinación de las estrategias mencionadas ha permitido lograr la expresión constitutiva, einducida, de una proteína de interés (TNF) en la s.n. del ratón. El análisis funcional de estos animales reveló que el TNF crónico inducido en algún momentode la vida adulta del animal provoca la lenta y progresiva desaparición de las neuronasdopaminérgicas de la s.n., representando un nuevo modelo de PD. Por otro lado, fue muy interesante observar que la expresión constitutiva de TNF logróaumentar 3 veces más el número de neuronas sobrevivientes que en los grupos controles ante eltratamiento de los animales con 6-hidroxidopamina (6-OHDa), una droga utilizada para modelar la PD. Estos resultados son un indicio para comenzar a comprender datos previos contradictorios de laliteratura, referidos a la muerte o protección de neuronas mediado por TNF (el efecto final en cadacaso podría depender de la concentración). La información aquí presentada será útil al considerar la posibilidad de una terapia que dealguna manera u otra afecte al TNF, o a cualquier otra citoquina (anti-inflamatorios, por ejemplo),como se ha realizado recientemente para esclerosis múltiple. Finalmente, la estrategia utilizada permitirá el estudio de las funciones de proteínas expresadasen la s.n. en forma controlada, y abre la posibilidad de establecer nuevos modelos animales de PD. Aún más, utilizando otros promotores endógenos, podrá permitir el estudio de otras patologíascrónicas en el cerebro. Parkinson Disease (PD) is a debilitating, long-term neurodegenerative disease, which mostimportant neuropathological feature is the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra (s.n.) of the brain. It is not known its cause, nor exists a cure for this disease. Immune cytokines have been found in the brain of patients with many neurodegenerativediseases, including PD. Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF) is a cytokine of particular interest,because it can induce both the survival or death of neurons. Importantly, it has been found in the s.n.of PD patients, but not in control subjects. Nevertheless, it is not known which function could have TNF in this disease. Combining “hypomorphic” knock-in mice and a promoter specific for the s.n. (engrailed), weobtained constitutive expression of TNF in the s.n. of mice. Combining two more elements (adenoviral vectors and the Cre-LoxP system), we had developed a model to obtain chronicexpression of different levels of TNF in vivo in the s.n. of mice. This system was used to study therole of this cytokine in the survival or death of dopaminergic neurons. We found that we could transduce dopaminergic neurons of the s.n. of adult mice with almost 100% efficiency with a single stereotaxic injection of adenoviral vectors. When knock-in mice were inoculated in this brain region with an adenoviral vector coding for Cre recombinase, a “floxed” PGK-neo cassette was recombined. In addition, s.n.-specific TNF expression was up-regulated in the AdCRE-injected knock-inmice but not in knock-in mice injected with Adbetagal or in AdCRE-injected control animals. Theseresults showed that the PGK-neo cassette had a “transcriptional interference” effect on TNFexpression. Moreover, the combination of the mentioned strategies allowed for the basal expression,and the temporal onset of an up-regulation, of a protein of interest in the s.n. of mice. When we analyzed the functional effects of TNF on neuronal viability, we found that longterm TNF up-regulation was deleterious, inducing the progressive death of dopaminergic neurons. This has provided us with a new animal model of PD. On the other hand, it was very interesting to observe that the constitutive expression of TNFcould protect 3 times more neurons than wt mice in an accepted PD model injecting 6-OHDa, aneurotoxin used as an accepted PD model, into the striatum. These results should help to understand previous contradictory data in the literature related tothe neuroprotective or neurodegenerative effects of TNF (the final effect could depend on subtledifferences on the TNF concentration). Even more, the information presented here should be considered when designing a possibletherapy for PD that could affect cytokines expression (and TNF in particular) in the s.n., as hasrecently been tested for multiple sclerosis. Finally, the strategy used in this work provides the means to analyze the function of proteinsexpressed in the s.n. in a temporal and regional controlled manner, and opens up the possibility toestablish other new animal models of PD. Even more, using other endogenous promoters, it shouldfacilitate the study of other chronic pathologies in the adult mouse brain. Fil: Di Paolo, Nelson César. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3466_DiPaolo spa Universidad de Buenos Aires. 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