Tiorredoxinas cloroplastídicas
Las Tiorredoxinas (Trxs) son proteínas que se encuentran en todos los sistemas biológicos y poseen una secuenciamuy conservada Cys—Gly-Pro—Cys cuyos tioles reducen los puentes disulfuro de una gran variedad de proteínas. Enlos cloroplastos de los organismos fotosíntéticos oxigénicos la reducción med...
Guardado en:
| Autor principal: | |
|---|---|
| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2001
|
| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3389_Duek http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3389_Duek_oai |
| Aporte de: |
| Sumario: | Las Tiorredoxinas (Trxs) son proteínas que se encuentran en todos los sistemas biológicos y poseen una secuenciamuy conservada Cys—Gly-Pro—Cys cuyos tioles reducen los puentes disulfuro de una gran variedad de proteínas. Enlos cloroplastos de los organismos fotosíntéticos oxigénicos la reducción mediada por la Trx modula la actividadproteica ya que este proceso promueve un cambio conformacional en la enzima sustrato. En esta organela se hancaracterizado dos Trxs filogenéticamente distantes: la Trx-m tendría un origen procarióticol mientras que la Trx-fpresenta gran homologia con la Trx humana. La Trx-f es particularmente eficiente en la modulación in vitro de laactividad la fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa), mientras que la Trx—m es ineficaz. La disponibilidad de las estructuras tridimensionales de las Trxs de diferentes organismos, su pequeño tamaño, gransolubilidad y termoestabilidad hacen de esta proteína un modelo interesante para el estudio de sus característicasconformacionales. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente a la Trx—m, y compararla con la Trx de Escherichia coli. La Trx bacteriana se tomó como referencia ya que ha sidoampliamente estudiada y presenta además un alto porcentaje de identidad con la Trx—m.Por otra parte, si bien todaslas Trxs comparten el mecanismo catalítico (el intercambio tiol-disulfuro) interaccionan con diferentes proteínas. Lasinteracciones no covalentes previas a la formación del disulfuro mixto serían las que determinan la especificidad de la Trx por los diferentes sustratos. En este sentido, se analizó la contribución de las interacciones electrostáticas en elreconocimiento Trx-m . cFBPasa. Para realizar estos estudios se aisló la secuencia codificante de la Trx—m de Brassicanapus (colza), se sobreexpresó en un sistema heterólogo y se purificó la proteína recombinante. Los aspectosestructurales y funcionales se analizaron mediante mutagénesis sitio-dirigida. A pesar de la gran homología estructural que tienen la Trx—m y la Trx de E. coli, casi todos los estudios realizadosmostraron que poseen diferencias fisicoquímicas y funcionales. La Trx—m fue menos eficiente que la Trx de E. coli enla reducción e isomerización de puentes disulfuro. Por otra parte, si bien las Trxs son muy termoestables la Trx—m esaún más estable que la Trx bacteriana. La mutante W17F Trx-m, que conserva los dos triptofanos próximos a lascisteínas catalíticas, permitió establecer que a pesar de que la Trx-m y la Trx bacteriana mantienen la geometría delsitio activol el entorno de estos triptofanos es distinto. Tanto la Trx—m salvaje como la mutante W17F tienen unrendimiento cuántico menor que la proteína bacteriana y la dependencia de la fluorescencia intrínseca con el pHtambién es distinta. Por otra parte, la mutante Wl7F permitió identificar que el triptofano l7 en la Trx-m es elresiduo que más contribuye a la emisión de la fluorescencia intrínseca de la proreína oxidada y contribuye también alespectro de dicroismo circular en el UV lejano. La importancia del triptofano 17 en el núcleo aromático de laproteína se determinó con el reemplazo por un residuo alifático y pequeño (WWA). Esta mutante modificó no sólolas propiedades estructurales (fluorescencia intrínseca y dicroismo circular en el UV lejano) sino también laestabilidad frente a perturbantes físicos y químicos. y la capacidad reductora (insulina y cFBPasa). La prolina en la posición 35 está estrictamente conservada en las Trxs-m y ausente en todas las otras. El reemplazo deesta prolina aumentó la sensibilidad de la molécula a perturbantes químicos y fisicos. La incorporación de una cargapositiva en esa posición (P35K) favoreció la interacción con la cFBPasa, mientras que una carga negativa la empeoró (P35E). Estos resultados son congruentes con la densidad de cargas negativas que rodea a las cisteínas de la cFBPasasujetas a la regulación redox y al contenido de cargas positivas que rodea el sitio activo de la Trx—f,el modulador máseficiente. Por otra parte. altas concentraciones salinas condujeron a todas la Trxs a valores similares de activación. Como conclusión, la cFBPasa discriminaría a las distintas Trxs por interacciones electrostáticas de largo alcance, quedeterminarían la diferente eficiencia de las Trxs en la modulación de la actividad de esta enzima. Sin embargo, lasinteracciones electrostáticas no influirían en la interacción entre la Trx y la malato deshidrogenasa, ya que todas lasmutantes en la Pro35 resultaron menos eficientes en la acrivación que la Trx-m salvaje El conjunto de estosresultados no sólo establece la participación de las interacciones electrostáticas sino también revela la contribución deotros factores en la formación del complejo no covalente (Trx-m)reducida/(proteína sustrato)oxidada. |
|---|