Tiorredoxinas cloroplastídicas

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Las Tiorredoxinas (Trxs) son proteínas que se encuentran en todos los sistemas biológicos y poseen una secuenciamuy conservada Cys—Gly-Pro—Cys cuyos tioles reducen los puentes disulfuro de una gran variedad de proteínas. Enlos cloroplastos de los organismos fotosíntéticos oxigénicos la reducción med...

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Autor principal:	Duek, Paula Débora
Otros Autores:	Wolosiuk, Ricardo Alejandro
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2001
Materias:	TIORREDOXINA INTERACCIONES ELECTROSTATICAS INTERCAMBIO TIOL/DISULFURO REGULACION REDOX CLOROPLASTO THIOREDOXIN ELECTROSTATIC INTERACTIONS THIOL/DISULFIDE INTERCHANGE REDOX REGULATION CHLOROPLAST
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3389_Duek http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3389_Duek_oai
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description	Las Tiorredoxinas (Trxs) son proteínas que se encuentran en todos los sistemas biológicos y poseen una secuenciamuy conservada Cys—Gly-Pro—Cys cuyos tioles reducen los puentes disulfuro de una gran variedad de proteínas. Enlos cloroplastos de los organismos fotosíntéticos oxigénicos la reducción mediada por la Trx modula la actividadproteica ya que este proceso promueve un cambio conformacional en la enzima sustrato. En esta organela se hancaracterizado dos Trxs filogenéticamente distantes: la Trx-m tendría un origen procarióticol mientras que la Trx-fpresenta gran homologia con la Trx humana. La Trx-f es particularmente eficiente en la modulación in vitro de laactividad la fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa), mientras que la Trx—m es ineficaz. La disponibilidad de las estructuras tridimensionales de las Trxs de diferentes organismos, su pequeño tamaño, gransolubilidad y termoestabilidad hacen de esta proteína un modelo interesante para el estudio de sus característicasconformacionales. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente a la Trx—m, y compararla con la Trx de Escherichia coli. La Trx bacteriana se tomó como referencia ya que ha sidoampliamente estudiada y presenta además un alto porcentaje de identidad con la Trx—m.Por otra parte, si bien todaslas Trxs comparten el mecanismo catalítico (el intercambio tiol-disulfuro) interaccionan con diferentes proteínas. Lasinteracciones no covalentes previas a la formación del disulfuro mixto serían las que determinan la especificidad de la Trx por los diferentes sustratos. En este sentido, se analizó la contribución de las interacciones electrostáticas en elreconocimiento Trx-m . cFBPasa. Para realizar estos estudios se aisló la secuencia codificante de la Trx—m de Brassicanapus (colza), se sobreexpresó en un sistema heterólogo y se purificó la proteína recombinante. Los aspectosestructurales y funcionales se analizaron mediante mutagénesis sitio-dirigida. A pesar de la gran homología estructural que tienen la Trx—m y la Trx de E. coli, casi todos los estudios realizadosmostraron que poseen diferencias fisicoquímicas y funcionales. La Trx—m fue menos eficiente que la Trx de E. coli enla reducción e isomerización de puentes disulfuro. Por otra parte, si bien las Trxs son muy termoestables la Trx—m esaún más estable que la Trx bacteriana. La mutante W17F Trx-m, que conserva los dos triptofanos próximos a lascisteínas catalíticas, permitió establecer que a pesar de que la Trx-m y la Trx bacteriana mantienen la geometría delsitio activol el entorno de estos triptofanos es distinto. Tanto la Trx—m salvaje como la mutante W17F tienen unrendimiento cuántico menor que la proteína bacteriana y la dependencia de la fluorescencia intrínseca con el pHtambién es distinta. Por otra parte, la mutante Wl7F permitió identificar que el triptofano l7 en la Trx-m es elresiduo que más contribuye a la emisión de la fluorescencia intrínseca de la proreína oxidada y contribuye también alespectro de dicroismo circular en el UV lejano. La importancia del triptofano 17 en el núcleo aromático de laproteína se determinó con el reemplazo por un residuo alifático y pequeño (WWA). Esta mutante modificó no sólolas propiedades estructurales (fluorescencia intrínseca y dicroismo circular en el UV lejano) sino también laestabilidad frente a perturbantes físicos y químicos. y la capacidad reductora (insulina y cFBPasa). La prolina en la posición 35 está estrictamente conservada en las Trxs-m y ausente en todas las otras. El reemplazo deesta prolina aumentó la sensibilidad de la molécula a perturbantes químicos y fisicos. La incorporación de una cargapositiva en esa posición (P35K) favoreció la interacción con la cFBPasa, mientras que una carga negativa la empeoró (P35E). Estos resultados son congruentes con la densidad de cargas negativas que rodea a las cisteínas de la cFBPasasujetas a la regulación redox y al contenido de cargas positivas que rodea el sitio activo de la Trx—f,el modulador máseficiente. Por otra parte. altas concentraciones salinas condujeron a todas la Trxs a valores similares de activación. Como conclusión, la cFBPasa discriminaría a las distintas Trxs por interacciones electrostáticas de largo alcance, quedeterminarían la diferente eficiencia de las Trxs en la modulación de la actividad de esta enzima. Sin embargo, lasinteracciones electrostáticas no influirían en la interacción entre la Trx y la malato deshidrogenasa, ya que todas lasmutantes en la Pro35 resultaron menos eficientes en la acrivación que la Trx-m salvaje El conjunto de estosresultados no sólo establece la participación de las interacciones electrostáticas sino también revela la contribución deotros factores en la formación del complejo no covalente (Trx-m)reducida/(proteína sustrato)oxidada.
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La disponibilidad de las estructuras tridimensionales de las Trxs de diferentes organismos, su pequeño tamaño, gransolubilidad y termoestabilidad hacen de esta proteína un modelo interesante para el estudio de sus característicasconformacionales. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente a la Trx—m, y compararla con la Trx de Escherichia coli. La Trx bacteriana se tomó como referencia ya que ha sidoampliamente estudiada y presenta además un alto porcentaje de identidad con la Trx—m.Por otra parte, si bien todaslas Trxs comparten el mecanismo catalítico (el intercambio tiol-disulfuro) interaccionan con diferentes proteínas. Lasinteracciones no covalentes previas a la formación del disulfuro mixto serían las que determinan la especificidad de la Trx por los diferentes sustratos. En este sentido, se analizó la contribución de las interacciones electrostáticas en elreconocimiento Trx-m . cFBPasa. Para realizar estos estudios se aisló la secuencia codificante de la Trx—m de Brassicanapus (colza), se sobreexpresó en un sistema heterólogo y se purificó la proteína recombinante. Los aspectosestructurales y funcionales se analizaron mediante mutagénesis sitio-dirigida. A pesar de la gran homología estructural que tienen la Trx—m y la Trx de E. coli, casi todos los estudios realizadosmostraron que poseen diferencias fisicoquímicas y funcionales. La Trx—m fue menos eficiente que la Trx de E. coli enla reducción e isomerización de puentes disulfuro. Por otra parte, si bien las Trxs son muy termoestables la Trx—m esaún más estable que la Trx bacteriana. La mutante W17F Trx-m, que conserva los dos triptofanos próximos a lascisteínas catalíticas, permitió establecer que a pesar de que la Trx-m y la Trx bacteriana mantienen la geometría delsitio activol el entorno de estos triptofanos es distinto. Tanto la Trx—m salvaje como la mutante W17F tienen unrendimiento cuántico menor que la proteína bacteriana y la dependencia de la fluorescencia intrínseca con el pHtambién es distinta. Por otra parte, la mutante Wl7F permitió identificar que el triptofano l7 en la Trx-m es elresiduo que más contribuye a la emisión de la fluorescencia intrínseca de la proreína oxidada y contribuye también alespectro de dicroismo circular en el UV lejano. La importancia del triptofano 17 en el núcleo aromático de laproteína se determinó con el reemplazo por un residuo alifático y pequeño (WWA). Esta mutante modificó no sólolas propiedades estructurales (fluorescencia intrínseca y dicroismo circular en el UV lejano) sino también laestabilidad frente a perturbantes físicos y químicos. y la capacidad reductora (insulina y cFBPasa). La prolina en la posición 35 está estrictamente conservada en las Trxs-m y ausente en todas las otras. El reemplazo deesta prolina aumentó la sensibilidad de la molécula a perturbantes químicos y fisicos. La incorporación de una cargapositiva en esa posición (P35K) favoreció la interacción con la cFBPasa, mientras que una carga negativa la empeoró (P35E). Estos resultados son congruentes con la densidad de cargas negativas que rodea a las cisteínas de la cFBPasasujetas a la regulación redox y al contenido de cargas positivas que rodea el sitio activo de la Trx—f,el modulador máseficiente. Por otra parte. altas concentraciones salinas condujeron a todas la Trxs a valores similares de activación. Como conclusión, la cFBPasa discriminaría a las distintas Trxs por interacciones electrostáticas de largo alcance, quedeterminarían la diferente eficiencia de las Trxs en la modulación de la actividad de esta enzima. Sin embargo, lasinteracciones electrostáticas no influirían en la interacción entre la Trx y la malato deshidrogenasa, ya que todas lasmutantes en la Pro35 resultaron menos eficientes en la acrivación que la Trx-m salvaje El conjunto de estosresultados no sólo establece la participación de las interacciones electrostáticas sino también revela la contribución deotros factores en la formación del complejo no covalente (Trx-m)reducida/(proteína sustrato)oxidada. Thioredoxins (Trxs) are found in all biological systems. They have a very conserved sequence Cys-Gly-Pro—Cyswhose thiols reduce a wide array of protein disulfide bridges. In chloroplasts of oxygenic photosynthetic organismreduction carried out by Trxs modulate protein activity, as this process promotes conformational changes in proteins. In this organelle two phylogenetically divergent Trxs have been charaCterized: Trx—m of prokaryotic origin, while Trx—fdisplays great homology with human Trx. In vitro. Trx—fis particularly efficient modulating fructose—1,6-bisfosfatase (cFBPase) activity, whereas Trx—m is inefficient. The availability of Trx three-dimensional structures from different species, their small size, great solubility andtermostability made them an interesting model for studying their Structure. One of the objectives of this thesis was tocharacterize Trx-m structurally and functionally, and compare it with Escherichiacoli Trx. Prokaryotic Trx was takenas reference since it has been extensively studied and has high identity with Trx-m. On the other hand, although all Trxs share the same catalytic mechanism (thiol—disulfide exchange), they interact with different proteins. Noncovalent interactions prior to the formation of the disulfide mixed would determine the specificity of Trx by differentsubstrates. In this context, electrostatic interactions in Trx-m/cFBPase recognition were analyzed. For these purposesthe coding sequence of Brassica napus (rapeseed) Trx-m was determined, and the recombinant protein wasoverexpressed and purified. The study of functional and structural aspects was followed by a site-directed mutagenesisstrategy. In spite of the great structural homology shared by Trx—mand E. coli Trx, almost all the studies carried out showedthat they possess physicochemical and functional differences. Trx—m was less efficient than E. coli Trx in reductionand isomerization of disulfide bridges. On the other hand, although Trxs are very stable, our studies showed that Trxmis still more stable than prokaryotic Trx. W17F mutant of Trx—m conserves tryptophans near the cataliticcysteines. This mutant established that in spite of the fact that Trx-m and E. coli Trx maintain the geometry of theactive site, the environment of these tryptophans is distinct. Both wild type Trx-m and Wl7F mutant have a lowerquantum yield than prokaryotic protein and the intrinsic fluorescence in function of pH shows a different behavior. On the other hand, W17F mutant allowed us to identify that triptophan 17 in Trx-m is the residue that contributesmore to the fluorescence emission of oxidized protein and also contributes to UV dicroism circular. The role of Trpl7in the protein aromatic nucleus was determined replacing Trpl7 with a small and aliphatic residue (W17A). Thismutant modified not only the structural properties (intrinsic fluorescence and UV circular dicroism) but also thestability towards physical and chemical perturbants. and reducing capacity (insulin and cFBPase). Proline in position 35 is strictly conserved in Trxs-m and absent in all the other. Replacement of proline enlarged thesensibility of the molecule to chemical and physical perturbants. Incorporation of a positive charge in that position (P35K) favored the interaction with cFBPase. while a negative charge impaired it (P35E). These results arecongruent with the great negative density of charges that surround the redox regulating cysteins of cFBPase and themajor positive charges that surround the active site of Trx—f,the more efficient modulator. On the other hand, highsalt concentration conducted to all Trxs to similar values of activation. As conclusion, cFBPase would discriminatedistinct Trxs by long—range electrostatic interactions. which would determine the different efficiency of Trxs inmodulating enzyme activity. However, interactions would not influence interaction among Trx and malatedehydrogenase, since all mutants in Pr035 resulted less efficient in activation that wild type Trx—m.These resultsestablish the participation of electrostatic interactions but also reveal the contribution of other factors in theformation of the non covalent complex (Trx-m)reduced/(substrate protein) oxidized. Fil: Duek, Paula Débora. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3389_Duek spa Universidad de Buenos Aires. 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