La preservación multiobjetivo de alimentos : Efecto de factores tradicionales y emergentes en la respuesta de Aspergillus flavus

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El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la interacción de distintos factores de estrés (aw, pH, antimicrobianos sintetizados químicamente o antimicrobianos naturales y sus mezclas binarias) en larespuesta de crecimiento de Aspergillus flavus y determinar las condiciones de combinación inh...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	López-Malo Vigil, Aurelio
Otros Autores:	Alzamora, Stella Maris
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2000
Materias:	CONSERVACION DE ALIMENTOS MICROORGANISMOS DETERIORATIVOS ASPERGILLUS FLAVUS MICROBIOLOGIA PREDICTIVA ANTIMICROBIANOS NATURALES FOOD PRESERVATION SPOILAGE MICRORGANISMS PREDICTIVE MICROBIOLOGY NATURAL ANTIMICROBIALS
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3294_LopezMaloVigil http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3294_LopezMaloVigil_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la interacción de distintos factores de estrés (aw, pH, antimicrobianos sintetizados químicamente o antimicrobianos naturales y sus mezclas binarias) en larespuesta de crecimiento de Aspergillus flavus y determinar las condiciones de combinación inhibitoriassinérgicas o de cooperación de dichos factores, con miras a generar modelos predictivos para la conservaciónmultiobjetivo de alimentos. Se determinó el efecto de distintas combinaciones de factores de estrés, tales como actividad de agua (0,99 o 0,95), pH (4,5 o 3,5) y presencia de antimicrobianos sintetizados artificialmente (benzoato de sodio, bisulfitode sodio o sorbato de potasio) y/o antimicrobianos naturales (vainillina, eugenol, carvacrol, timol o citral)sobre la respuesta de crecimiento de Aspergillus flavus. Se formularon sistemas modelo tomando como mediobase al agar papa-dextrosa adicionando las cantidades necesarias de sacarosa y ácido clorhídrico para ajustarla actividad de agua y el pH según el caso y adicionando desde 100 hasta 1,800 ppm de los antimicrobianosen forma individual o en combinaciones binarias de los antimicrobianos. En cada caso los medios sólidosfueron inoculados con 2 μL de una suspensión de esporas del moho y se registró el tiempo para detectar elinicio del crecimiento de la colonia y/o su cambio en diámetro en función del tiempo de incubación. En los sistemas formulados con algún agente antimicrobiano y donde el moho se desarrolló, la velocidad decrecimiento radial varió de 0,037 (a.w 0,95; pH 3,5; 500 ppm eugenol) a 0,609 mm/h (aw 0,99; pH 4,5; 100ppm benzoato de sodio). El tiempo lag se incrementó conforme aumentó la concentración del agenteantimicrobiano, por ejemplo, el tiempo lag se alargó aproximadamente 330 horas (cerca de 14 días) enmedios formulados con 200 ppm de timol, aw 0,99 y pH 3,5 y con 300 ppm de este agente el tiempo paradetectar la presencia del moho se retraso 1400 horas (más de 55 días). Se determinaron las concentracionesmínimas inhibitorias de antimicrobianos comunes y naturales para Aspergillus flavus, mostrándose cuando seutilizó benzoato de sodio, bilsulfito de sodio o sorbato de potasio, una dependencia en el valor de pH, y estadependencia fue más notoria a valores de aw altos (0,99). A valores de aw bajos (0,95), se observó lainteracción de la presencia de 300 ppm sorbato de potasio y un pH de 4,5 en la inhibición del moho. Elsorbato de potasio junto con carvacrol y timol fueron los antimicrobianos más efectivos para estacombinación aw- pH. Se modeló utilizando el modelo de Fermi la respuesta a la dosis (cantidad de agenteantimicrobiano) para todas las combinaciones antimicrobiano - pH - aw evaluadas. La respuesta del moho seexpresó como el cociente entre el tiempo lag con respecto al tiempo lag del sistema control mostrando latípica forma sigmoide de las curvas de respuesta a la dosis. Se observaron diferencias importantes en losvalores de los coeficientes de la fución de Fermi (Pc y k) para los diferentes agentes antimicrobianos, asícomo para los distintos valores de aw y pH evaluados. Los resultados mostraron que las concentraciones delos agentes antimicrobianos naturales necesarias para duplicar el tiempo lag que se obtiene en el sistemacontrol no dependen tanto del pH del sistema, como en el caso de los agentes antimicrobianos sintéticos. Se determinó la interacción entre los distintos factores cuando se aplicaron en distintos niveles sobre lainterferencia de la homeostasis de Aspergillus flavus y se determinaron condiciones sinérgicas o decooperación para la inhibición y retraso en el crecimiento del moho, evaluando la respuesta de Aspergillusflavus a diferentes mezclas binarias de antimicrobianos comunes y naturales. No se observó crecimiento delmoho a tiempos de incubación largos conforme se aumentó la concentración de los agentes antimicrobianosen la mezcla. Se observaron también importantes diferencias en el comportamiento del moho en los mediosformulados con distinto valor de pH, así como entre las diferentes mezclas de agentes antimicrobianos. Lasmezclas de los distintos agentes retrasaron el crecimiento al menos 5 días en muchos de los casos, resaltandoel comportamiento de las mezclas con citral en donde se observó que en el 58% de los casos (274 de un totalde 474) a pH 3,5 y en el 53% (253 de 474) a pH 4,5 las observaciones fueron de no crecimiento después de 5días y de crecimiento a los 30 días de incubación. Cada uno de los resultados de las observaciones delcrecimiento o no crecimiento de Aspergillus flavus se representaron mediante un isobolograma, utilizandopara las diferentes condiciones de pH (4,5 o 3,5) y períodos de incubación(5, 10, 15 o 30 días), lasconcentraciones fraccionales inhibitorias (CFI) de cada agente en la mezcla. Los CFI índices (calculadoscomo la suma de los CFI de cada agente en la mezcla) para las combinaciones de agentes antimicrobianosevaluados después de 30 días de incubación, variaron de 0,125 (pH 4,5; 50 ppm timol y 800 ppm vainillina) a 1,764 (pH 3,5; 1600 ppm citral y 50 ppm timol). Los CFI índices mostraron comportamientos de sinergismo,aditividad o antagonismo dependiendo de los agentes y sus niveles en las diferentes mezclas, y también deltiempo de incubación. Se realizaron experimentos que permitieron el modelado matemático (probabilístico) de la interfase entrecrecimiento y no-crecimiento de Aspergillus flavus bajo diferentes condiciones de actividad de agua (0,98; 0,96 o 0,94), pH (5,0; 4,0 o 3,0), temperatura de incubación (15 o 25°C) y concentración (0, 200, 400, 600, 800 o 1000 ppm) de benzoato de sodio o vainillina. Los resultados se interpretaron utilizando modelospredictivos con miras a ser utilizados en la conservación multiobjetivo de alimentos, evaluando lasupervivencia del moho a los diferentes factores y prediciendo las condiciones letales y/o inhibitorias. Seobservó un efecto importante del tiempo de incubación, ya que combinaciones inhibitorias del crecimiento delmoho a tiempos cortos resultaron positivas (crecimiento) con tiempos de incubación más prolongados,demostrando el efecto sobre el tiempo lag de A. flavus de los factores empleados en las distintascombinaciones estudiadas. Utilizando regresión logística se obtuvo un modelo polinomial con alto porcentajede concordancia entre los datos (>93%) además las pruebas de Hosmer y Lemeshow y de Chi-cuadradodieron resultados significativos, lo que demuestra la bondad en el ajuste del modelo propuesto para predecirla respuesta (probabilidad de crecimiento) de Aspergillus flavus. El modelo permitió calcular la probabilidadde crecimiento del moho cuando fue inoculado en medios formulados con distintos valores de aw, pH,concentraciones de benzoato de sodio o vainillina e incubado por diferentes tiempos a distintas temperaturas. Se observó que la probabilidad de crecimiento del moho disminuyó conforme disminuyó la temperatura deincubación, el pH y la aw y conforme aumentó la concentración de los agentes antimicrobianos. Laprobabilidad de que el moho se desarrollara fue menor en los casos en los que el medio contenía benzoato desodio. El modelo logístico permitió predecir la respuesta del moho bajo diferentes combinaciones de lasvariables si se establecía un nivel de probabilidad para que el evento (crecimiento) ocurriera. Al disminuir elvalor de probabilidad los niveles de las variables empleadas en la combinación deberían ser más severos;menor temperatura de incubación, menor pH, menor aw, mayor concentración de agente antimicrobiano omenor tiempo de incubación o el uso de vainillina como antimicrobiano, para asegurar con esa probabilidadque el evento ocurriera (o con el complemento de la probabilidad que el evento no ocurriera).
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spelling	I28-R145-tesis_n3294_LopezMaloVigil_oai2023-04-26 Alzamora, Stella Maris López-Malo Vigil, Aurelio 2000 El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la interacción de distintos factores de estrés (aw, pH, antimicrobianos sintetizados químicamente o antimicrobianos naturales y sus mezclas binarias) en larespuesta de crecimiento de Aspergillus flavus y determinar las condiciones de combinación inhibitoriassinérgicas o de cooperación de dichos factores, con miras a generar modelos predictivos para la conservaciónmultiobjetivo de alimentos. Se determinó el efecto de distintas combinaciones de factores de estrés, tales como actividad de agua (0,99 o 0,95), pH (4,5 o 3,5) y presencia de antimicrobianos sintetizados artificialmente (benzoato de sodio, bisulfitode sodio o sorbato de potasio) y/o antimicrobianos naturales (vainillina, eugenol, carvacrol, timol o citral)sobre la respuesta de crecimiento de Aspergillus flavus. Se formularon sistemas modelo tomando como mediobase al agar papa-dextrosa adicionando las cantidades necesarias de sacarosa y ácido clorhídrico para ajustarla actividad de agua y el pH según el caso y adicionando desde 100 hasta 1,800 ppm de los antimicrobianosen forma individual o en combinaciones binarias de los antimicrobianos. En cada caso los medios sólidosfueron inoculados con 2 μL de una suspensión de esporas del moho y se registró el tiempo para detectar elinicio del crecimiento de la colonia y/o su cambio en diámetro en función del tiempo de incubación. En los sistemas formulados con algún agente antimicrobiano y donde el moho se desarrolló, la velocidad decrecimiento radial varió de 0,037 (a.w 0,95; pH 3,5; 500 ppm eugenol) a 0,609 mm/h (aw 0,99; pH 4,5; 100ppm benzoato de sodio). El tiempo lag se incrementó conforme aumentó la concentración del agenteantimicrobiano, por ejemplo, el tiempo lag se alargó aproximadamente 330 horas (cerca de 14 días) enmedios formulados con 200 ppm de timol, aw 0,99 y pH 3,5 y con 300 ppm de este agente el tiempo paradetectar la presencia del moho se retraso 1400 horas (más de 55 días). Se determinaron las concentracionesmínimas inhibitorias de antimicrobianos comunes y naturales para Aspergillus flavus, mostrándose cuando seutilizó benzoato de sodio, bilsulfito de sodio o sorbato de potasio, una dependencia en el valor de pH, y estadependencia fue más notoria a valores de aw altos (0,99). A valores de aw bajos (0,95), se observó lainteracción de la presencia de 300 ppm sorbato de potasio y un pH de 4,5 en la inhibición del moho. Elsorbato de potasio junto con carvacrol y timol fueron los antimicrobianos más efectivos para estacombinación aw- pH. Se modeló utilizando el modelo de Fermi la respuesta a la dosis (cantidad de agenteantimicrobiano) para todas las combinaciones antimicrobiano - pH - aw evaluadas. La respuesta del moho seexpresó como el cociente entre el tiempo lag con respecto al tiempo lag del sistema control mostrando latípica forma sigmoide de las curvas de respuesta a la dosis. Se observaron diferencias importantes en losvalores de los coeficientes de la fución de Fermi (Pc y k) para los diferentes agentes antimicrobianos, asícomo para los distintos valores de aw y pH evaluados. Los resultados mostraron que las concentraciones delos agentes antimicrobianos naturales necesarias para duplicar el tiempo lag que se obtiene en el sistemacontrol no dependen tanto del pH del sistema, como en el caso de los agentes antimicrobianos sintéticos. Se determinó la interacción entre los distintos factores cuando se aplicaron en distintos niveles sobre lainterferencia de la homeostasis de Aspergillus flavus y se determinaron condiciones sinérgicas o decooperación para la inhibición y retraso en el crecimiento del moho, evaluando la respuesta de Aspergillusflavus a diferentes mezclas binarias de antimicrobianos comunes y naturales. No se observó crecimiento delmoho a tiempos de incubación largos conforme se aumentó la concentración de los agentes antimicrobianosen la mezcla. Se observaron también importantes diferencias en el comportamiento del moho en los mediosformulados con distinto valor de pH, así como entre las diferentes mezclas de agentes antimicrobianos. Lasmezclas de los distintos agentes retrasaron el crecimiento al menos 5 días en muchos de los casos, resaltandoel comportamiento de las mezclas con citral en donde se observó que en el 58% de los casos (274 de un totalde 474) a pH 3,5 y en el 53% (253 de 474) a pH 4,5 las observaciones fueron de no crecimiento después de 5días y de crecimiento a los 30 días de incubación. Cada uno de los resultados de las observaciones delcrecimiento o no crecimiento de Aspergillus flavus se representaron mediante un isobolograma, utilizandopara las diferentes condiciones de pH (4,5 o 3,5) y períodos de incubación(5, 10, 15 o 30 días), lasconcentraciones fraccionales inhibitorias (CFI) de cada agente en la mezcla. Los CFI índices (calculadoscomo la suma de los CFI de cada agente en la mezcla) para las combinaciones de agentes antimicrobianosevaluados después de 30 días de incubación, variaron de 0,125 (pH 4,5; 50 ppm timol y 800 ppm vainillina) a 1,764 (pH 3,5; 1600 ppm citral y 50 ppm timol). Los CFI índices mostraron comportamientos de sinergismo,aditividad o antagonismo dependiendo de los agentes y sus niveles en las diferentes mezclas, y también deltiempo de incubación. Se realizaron experimentos que permitieron el modelado matemático (probabilístico) de la interfase entrecrecimiento y no-crecimiento de Aspergillus flavus bajo diferentes condiciones de actividad de agua (0,98; 0,96 o 0,94), pH (5,0; 4,0 o 3,0), temperatura de incubación (15 o 25°C) y concentración (0, 200, 400, 600, 800 o 1000 ppm) de benzoato de sodio o vainillina. Los resultados se interpretaron utilizando modelospredictivos con miras a ser utilizados en la conservación multiobjetivo de alimentos, evaluando lasupervivencia del moho a los diferentes factores y prediciendo las condiciones letales y/o inhibitorias. Seobservó un efecto importante del tiempo de incubación, ya que combinaciones inhibitorias del crecimiento delmoho a tiempos cortos resultaron positivas (crecimiento) con tiempos de incubación más prolongados,demostrando el efecto sobre el tiempo lag de A. flavus de los factores empleados en las distintascombinaciones estudiadas. Utilizando regresión logística se obtuvo un modelo polinomial con alto porcentajede concordancia entre los datos (>93%) además las pruebas de Hosmer y Lemeshow y de Chi-cuadradodieron resultados significativos, lo que demuestra la bondad en el ajuste del modelo propuesto para predecirla respuesta (probabilidad de crecimiento) de Aspergillus flavus. El modelo permitió calcular la probabilidadde crecimiento del moho cuando fue inoculado en medios formulados con distintos valores de aw, pH,concentraciones de benzoato de sodio o vainillina e incubado por diferentes tiempos a distintas temperaturas. Se observó que la probabilidad de crecimiento del moho disminuyó conforme disminuyó la temperatura deincubación, el pH y la aw y conforme aumentó la concentración de los agentes antimicrobianos. Laprobabilidad de que el moho se desarrollara fue menor en los casos en los que el medio contenía benzoato desodio. El modelo logístico permitió predecir la respuesta del moho bajo diferentes combinaciones de lasvariables si se establecía un nivel de probabilidad para que el evento (crecimiento) ocurriera. Al disminuir elvalor de probabilidad los niveles de las variables empleadas en la combinación deberían ser más severos;menor temperatura de incubación, menor pH, menor aw, mayor concentración de agente antimicrobiano omenor tiempo de incubación o el uso de vainillina como antimicrobiano, para asegurar con esa probabilidadque el evento ocurriera (o con el complemento de la probabilidad que el evento no ocurriera). The objective of this research was to evaluate the effects of several microbial stress factors interactions (aw,pH, chemical synthesized antimicrobials or natural antimicrobials and their mixtures) in the growth responseof Aspergillus flavus and to determine those combinations and conditions that cause a synergic inhibition andpermit modeling and predicting of mold response within a multitarget preservation of foods approach. The effects of several combinations of microbial stress factors such as water activity (0,99 or 0,95), pH (4,5or 3,5) and the presence of synthetic antimicrobials (sodium benzoate, sodium bisulfite or potassium sorbate)or naturally occurring antimicrobials (vanillin, eugenol, thymol, carvacrol or citral) on Aspergillus flavusgrowth response were evaluated. Potato dextrose agar was adjusted with the necessary quantities of sucroseand chlorhydric acid to attain aw and pH. l00, 200, 300 up to 1,800 ppm of individual or combinations ofeach antimicrobial agent were incorporated to the agar. Each formulated and solidified media was inoculatedwith 2 μL of A. flavus spore suspension and time to growth and/or colony diameter was recorded as afunction of incubation time. In those systems formulated with antimicrobial agents and where mold growth was observed, radial growthrate ranged from 0,037 (aw 0,95; pH 3,5; 500 ppm eugenol) to 0,609 mm/h (aw 0,99; pH 4,5; 100 ppm sodiumbenzoate). Lag time increased as antimicrobial agent concentration in the agar increased, in media containing 200 ppm thymol, aw 0.99 and pH 3.5 lag time was around 330 h (l4 days), with 300 ppm of the samephenolic compound the time to detect a visible colony was delayed around l400 h (55 days). Synthetic andnatural antimicrobial minimal inhibitory concentrations to Aspergillus flavus, indicated that the use of sodiumbenzoate, sodium bisulfite or potassium sorbate were pH dependent, being more noticeable at aw 0,99. At aw 0,95, an interaction between 300 ppm potassium sorbate and pH 4,5 to inhibit mold growth was observed. Potassium sorbate, carvacrol and thymol were the most effective antimicrobials tested in this aw—pHcombination. Using Fermi function, dose response models for each antimicrobial were obtained in each pH-aw combination. Mold growth response was expressed as the ration between the lag time with respect the lagtime obtained in the control media without antimicrobial, showing typical sigmoid form of dose responsecurves. Important differences in Fermi function parameters (Pc y k) were observed depending the type ofantimicrobial, aw and pH. The model demonstrated that natural antimicrobial concentration needed toduplicate lag time as compared with A. flavus lag time in the control a lesser pH dependence than theobserved with synthetic antimicrobials. An interaction between pH, aw and antimicrobial agent concentrationon mold growth response. Homeostatic Aspergillus flavus interference due to interactions of stress factors and selected levels wereevaluated in order to determine synergic situations that inhibit mold growth. Several binary combinations ofnatural and synthetic antimicrobials were tested against mold spore in model systems. At short incubationtimes A. flavus was unable to grow but with longer incubation times higher antimicrobial concentration wereneeded to inhibit growth. Mold respond in a different way depending on pH and antimicrobial type andconcentration. In many of the tested combinations no growth was observed after 5 days of incubation. Moldinoculated in media formulated with antimicrobial mixtures containing citral show a special behavior. 58% ofthe evaluated cases (274 of a total of 474) at pH 3,5 and in 53% (253 of 474) at pH 4,5; no growth wasobserved after 5 days and growth was observed after 30 days of incubation. Each growth or no growth resultobtained at pH 3,5 or 4, 5 and after 5, 10, 15 or 30 days of incubation, was transformed into fractionalinhibitory concentrations (FIC) and an isobologram plot was constructed for each evaluated antimicrobialmixture. FIC was calculated as the inhibitory concentration of each antimicrobial in the presence of the otherdivided by the individual inhibitory concentration. Isoblograms as well as FIC index show that values near to 1 represent additivity, values lower than 1 represent synergy and values higher than 1 represent antagonism. Calculated FIC index for 30 days of incubation ranged from 0,125 (pH 4,5; 50 ppm thymol and 800 ppmvanillin) to 1,764 (pH 3,5; 1600 ppm citral and 50 ppm thymol). FIC index presented synergy, additivity orantagonism depending of the antimicrobials mixed and their level in the mixture. Several experiments were carried out to mathematically model (probabilistic) Aspergillus flavus growth —nogrowth interface when inoculated in media formulated with selected water activity (0,98; 0,96 or 0,94), pH (5,0; 4,0 or 3,0), incubation temperature (15 or 25°C) and antimicrobial agent concentrations (0, 200, 400, 600, 800 o 1000 ppm) of sodium benzoate or vanillin. The results were interpreted using predictive equationsthat permit to describe and predict multi-target preservation of foods by using mold survival as a model. Incubation time has an important effect on mold inhibition, several inhibitory factor combinations inhibitmold growth for 100—200 h of incubation but with longer incubation times mold grew, demonstrating theeffect of the evaluated factors on mold lag time. Using logistic regression a polynomial equation was obtainedwith a higher than 93% of concordance between observed and predicted data. Hosmer and Lemeshow and Chi-square tests were significant indicating the goodness of fit of the model and its adequacy to predict theprobability of growth. The model permitted to calculate mold probability of growth when inoculated in mediaformulated with selected aw and pH values selected concentrations of sodium benzoate or vanillin andincubated at different temperatures for different times. The probability of growth diminished as incubationtemperature, pH and aw decreased and as antimicrobial concentration increased. Lower probability of growthwas obtained in those factor combinations that included sodium benzoate as antimicrobial than in thosecontaining vanillin. The logistic model permitted to predict the probability of growth under severalcombinations and also permitted to calculate the levels of the variables in the combination if a tolerableprobability level is pre-established. As the probability diminished, the levels of the variables in thecombination were more severe, lower incubation temperature, lower pH, lower aw, greater antimicrobialconcentration or shorter incubation time. Fil: López-Malo Vigil, Aurelio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3294_LopezMaloVigil spa Universidad de Buenos Aires. 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La preservación multiobjetivo de alimentos : Efecto de factores tradicionales y emergentes en la respuesta de Aspergillus flavus

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