Análisis funcional del antígeno repetitivo presente en la trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi

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El protozoario Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, expresaen su superficie moléculas con actividad trans-sialidasa. Esta actividad novedosa constituye laúnica vía de captación de residuos de ácido siálico en el parásito. La adquisición de estos azúcaresen glicoconjugados...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Buscaglia, Carlos Andrés
Otros Autores:	Frasch, Alberto Carlos C.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2000
Materias:	TRYPANOSOMA CRUZI TRANS-SIALIDASA ANTIGENOS REPETITIVOS ANTICUERPOS INHIBITORIOS DE TRANS-SIALIDASA FARMACOCINETICA TRANS-SIALIDASE REPETITIVE ANTIGENS TRANS-SIALIDASE INHIBITORY ANTIBODIES PHARMACOKINETICS
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3249_Buscaglia http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3249_Buscaglia_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	El protozoario Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, expresaen su superficie moléculas con actividad trans-sialidasa. Esta actividad novedosa constituye laúnica vía de captación de residuos de ácido siálico en el parásito. La adquisición de estos azúcaresen glicoconjugados aceptores de superficie es indispensable para el reconocimiento y/o la infecciónde células de mamífero. La trans-sialidasa presente en el estadío infectivo de T cruzi tiene unaestructura quimérica, compuesta por una región responsable de la actividad catalítica y un dominiorepetitivo altamente inmunogénico (SAPA). Esta proteína es también secretada espontáneamente asangre del hospedador mamífero con propósitos inciertos. En el transcurso de la presente Tesis, hemos realizado un análisis funcional del antígeno SAPA. Más precisamente, hemos evaluado el rol que podría estar cumpliendo este dominio en lainteracción de la trans-sialidasa con el sistema inmune y en la biodisponibilidad de la moléculasecretada. Con este propósito, generamos y expresamos en bacterias distintas trans-sialidasasrecombinantes conteniendo o no al dominio SAPA. Las mismas fueron administradas en ratonessiguiendo distintos protocolos de inmunización a fin de analizar el curso de la respuesta inmunehumoral contra uno y otro dominio. Por otro lado, realizamos un análisis farmacocinético de lasdistintas enzimas purificadas. De tal manera, demostramos que la presencia del dominio SAPA cumpliría un rol dualdurante la infección; en un primer momento, estabilizando la actividad trans-sialidasa en sangre, locual podría estar asociado al mecanismo de infección y/o a las alteraciones del sistema inmune quese verifican durante la fase aguda de la enfermedad. En etapas más tardías, la presencia del dominio SAPA induce la formación de anticuerpos capaces de neutralizar la actividad trans-sialidasa. Larespuesta inmune inicial dirigida contra el dominio SAPA y/o la estabilización en sangre de lamolécula secretada en su conformación nativa podrían estar mediando la difusión de la respuestahumoral hacia epitopes presentes en la región catalítica. De hecho, también demostramos que losanticuerpos inhibitorios de trans-sialidasa están dirigidos contra epitope/s discontinuo/s en lasecuencia primaria de la enzima. Estos resultados son coincidentes con los datos clínicos, en los que se observa una faseinicial de la infección en la que puede llegar a detectarse actividad trans-sialidasa en circulación (asociado a altos niveles de parasitemia) y una fase tardía caracterizada por la presencia de anticuerposinhibitorios de dicha actividad (asociado a bajas o nulas parasitemias). La inducción de anticuerposinhibitorios mediada por SAPA contradice el rol inmunodistractor propuesto para este antígenorepetitivo, y sugiere un mecanismo seleccionado en la interacción parásito-hospedador para elestablecimiento de una infección crónica. La estabilización de la actividad trans-sialidasa en sangre requiere de un número mínimode unidades repetitivas y no depende de las secuencias no repetitivas presentes en el antígeno SAPA. El mecanismo molecular por el cual estas repeticiones aumentan la vida media de la transsialidasaen circulación no ha podido ser dilucidado, aunque no está mediado por una mayorresistencia a la degradación por proteasas séricas ni por unión de estas repeticiones a alguna proteínaendógena. De manera interesante, el dominio SAPA es también capaz de estabilizar la conformaciónnativa de otra proteína en sangre, en absoluto relacionada a la trans-sialidasa, por lo cual se sugiereuna posible aplicación biotecnológica.
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Más precisamente, hemos evaluado el rol que podría estar cumpliendo este dominio en lainteracción de la trans-sialidasa con el sistema inmune y en la biodisponibilidad de la moléculasecretada. Con este propósito, generamos y expresamos en bacterias distintas trans-sialidasasrecombinantes conteniendo o no al dominio SAPA. Las mismas fueron administradas en ratonessiguiendo distintos protocolos de inmunización a fin de analizar el curso de la respuesta inmunehumoral contra uno y otro dominio. Por otro lado, realizamos un análisis farmacocinético de lasdistintas enzimas purificadas. De tal manera, demostramos que la presencia del dominio SAPA cumpliría un rol dualdurante la infección; en un primer momento, estabilizando la actividad trans-sialidasa en sangre, locual podría estar asociado al mecanismo de infección y/o a las alteraciones del sistema inmune quese verifican durante la fase aguda de la enfermedad. En etapas más tardías, la presencia del dominio SAPA induce la formación de anticuerpos capaces de neutralizar la actividad trans-sialidasa. Larespuesta inmune inicial dirigida contra el dominio SAPA y/o la estabilización en sangre de lamolécula secretada en su conformación nativa podrían estar mediando la difusión de la respuestahumoral hacia epitopes presentes en la región catalítica. De hecho, también demostramos que losanticuerpos inhibitorios de trans-sialidasa están dirigidos contra epitope/s discontinuo/s en lasecuencia primaria de la enzima. Estos resultados son coincidentes con los datos clínicos, en los que se observa una faseinicial de la infección en la que puede llegar a detectarse actividad trans-sialidasa en circulación (asociado a altos niveles de parasitemia) y una fase tardía caracterizada por la presencia de anticuerposinhibitorios de dicha actividad (asociado a bajas o nulas parasitemias). La inducción de anticuerposinhibitorios mediada por SAPA contradice el rol inmunodistractor propuesto para este antígenorepetitivo, y sugiere un mecanismo seleccionado en la interacción parásito-hospedador para elestablecimiento de una infección crónica. La estabilización de la actividad trans-sialidasa en sangre requiere de un número mínimode unidades repetitivas y no depende de las secuencias no repetitivas presentes en el antígeno SAPA. El mecanismo molecular por el cual estas repeticiones aumentan la vida media de la transsialidasaen circulación no ha podido ser dilucidado, aunque no está mediado por una mayorresistencia a la degradación por proteasas séricas ni por unión de estas repeticiones a alguna proteínaendógena. De manera interesante, el dominio SAPA es también capaz de estabilizar la conformaciónnativa de otra proteína en sangre, en absoluto relacionada a la trans-sialidasa, por lo cual se sugiereuna posible aplicación biotecnológica. The protozoan Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas' disease, expresses trans-sialidasemolecules on its surface. The acquisition of sialic acid residues in T. cruzi could only beaccomplished by virtue of this novel enzymatic activity. The sialylation of surface glycoconjugatesis required in order to interact with and/or to infect mammalian cells. The trans-sialidase displayedby the infective form of the parasite resembles a naturally occurring chimera, made up of a catalyticregion and a highly immunogenic, repetitive domain (SAPA). This protein is also spontaneouslyshed into the bloodstream of the mammalian host with unknown purposes. In the course of the present PhD work, we have performed a functional analysis of theantigen SAPA. In this respect, we have evaluated the possible role of this repetitive domain on theinteraction between trans-sialidase and the immune system and on the bioavailability of the secretedmolecule. For this purpose, we have constructed and expressed in bacteria different recombinant transsialidases,either containing or lacking the repetitive extension. These enzymes were used to performdifferent immunization protocols in mice in order to analyze the humoral immune response againsteach region. On the other hand, we have analyzed the pharmacokinetics of the purified trans-sialidases. We demonstrate that SAPA have a dual effect, first stabilizing the enzymatic activity inblood, which might be related to the infectious process and/or the modulation of the immune system. On a second step, the presence of SAPArepeats in cis promotes the generation of antibodies able toneutralize the trans-sialidase activity. The early immune reSponse against SAPA and/or thestabilization in blood of the enzyme on its native conformation might be involved in the spreadingof the humoral response towards epitopes present on the catalytic region. In fact, we also demonstratethat antibodies able to inhibit trans-sialidase activity recognize discontinuous epitope(s) within theenzymatic region. These results are similar to those obtained in vivo during the course of infection. After aninitial phase characterized by trans-sialidase activity in blood (and high levels of parasitemia)circulating antibodies able to inhibit trans-sialidase could be detected. The appearance of theseantibodies correlate with the establishment of an indeterrninate phase where parasites are barelydetected in blood. At variance with present views, SAPA does not act as an immunodistractor butinstead promote the generation of inhibitory antibodies. This mechanism could have been selectedfor in the parasite-host interaction to modulate the infection. The stabilization of trans-sialidase activity in blood depends on a minimum number ofrepetitive units and not on non-repetitive sequences present in SAPA. The molecular basis of thisstabilization are not yet understood. Even though, SAPA repeats do not protect the catalytic domainagainst serum proteases neither mediate the binding to an endogenous molecule. Interestingly, SAPA repeats also increases the half-life in blood of a protein unrelated to trans-sialidase. Thus, itsbiotechnological potential could be envisaged. Fil: Buscaglia, Carlos Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3249_Buscaglia spa Universidad de Buenos Aires. 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