Estudio del mecanismo de activación de la quinasa de proteínas dependiente de cAMP

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El objetivo general de esta tesis es contribuir al estudio del mecanismo deactivación de las proteinas quinasas dependientes de cAMP (PK A). Algunos de losgrandes problemas a dilucidar en este tema son: si la enzima necesita disociarse ensus subunidades catalltica y regulatoria para activarse por cA...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Zaremberg, Vanina
Otros Autores: Moreno de Colonna, Silvia M.
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1999
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3220_Zaremberg
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3220_Zaremberg_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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spelling I28-R145-tesis_n3220_Zaremberg_oai2023-04-26 Moreno de Colonna, Silvia M. Zaremberg, Vanina 1999 El objetivo general de esta tesis es contribuir al estudio del mecanismo deactivación de las proteinas quinasas dependientes de cAMP (PK A). Algunos de losgrandes problemas a dilucidar en este tema son: si la enzima necesita disociarse ensus subunidades catalltica y regulatoria para activarse por cAMP , si el cAMP es elúnico agente necesario para la activación de la enzima y cómo se adquiere laselectividad de sustratos. Para este trabajo se han utilizado como modelos dos eucariontes inferiores. 1) PKA parcialmente purificada del hongo dimórflco Mucor rouxii, y ensayos in vitro. 2) Mutantes de subunidad regulatoria (bcy1) de la PKA de la levadura Saccharomyces cerevisiae con un abordaje genético-bioquímico-molecular. Utilizando el primer modelo y trabajando a concentraciones de holoenzima delorden de nM hemos llegado a las siguientes conclusiones (Mechanism of activationof cAMP-dependent protein kinase. In Mucor rouxii the apparont specific activity ofthe CAMP activated holoenzyme is different to that of its free catalytic subunit”. V.Zaremberg, A.Donnella-Deana and S.Moreno. Enviado a Archives in Biochemistryand Biophysics). - en este rango de concentración la actividad enzimática utilizando péptidos sintéticoscomo sustratos no es lineal con la concentración de enzima. Con la proteinaprotamina, utilizada como referencia, la actividad es casi lineal en el mismo rangode concentración. - la dependencia de la actividad fosforilante de cada péptido, con el cAMP, el gradode inhibición por un péptido inhibidor especifico y la modulación por policationesdependen del péptido utilizado. - en todos los ensayos arriba mencionados la relación de las actividades fosforilantesde la enzima con los distintos péptidos, comparados entre si o con la protamina, esdiferente a la misma relación estimada a partir de las actividades medidas con lasubunidad catalitica libre. Estos resultados se explican con dos modelos posibles: a) la subunidadcatalitica libre es la entidad que fosforila los sustratos y el nivel de producción desubunidad C depende del cAMP y del sustrato; b) a altas concentraciones deholoenzima, existe holoenzima sin disociar con cAMP unido; esta especie escataliticamente activa y la selectividad de esta especie por los sustratos es diferente ala de la subunidad catalitica libre. En el segundo modelo se han utilizado mutantes espontáneas, cedidas por el Dr. Kelly Tatchell, en el gen que codifica para la subunidad regulatoria (bcy1) de la PKA. En un primer trabajo (Analysis of the mechanism of activation of cAMPdependentprotein kinase through the study of mutants of the yeast regulatorysubunit. ” V.Zaremberg and S.Moreno, Eur.J.Biochem. 237: 136-142, 1996)trabajando con las cepas mutantes se obtuvieron los siguientes resultados: - los niveles de las subunidades regulatoria ( R) y catalltica (C ) en las cepas mutadasson similares a los de la cepa salvaje. - Una medida aproximada de la afinidad de las subunidades R mutadas por el CAMP,indicó que se encuentra disminuida. - Midiendoactividad de PKA en células penneadas en ausencia y presencia de cAMP,se encontró que las mutantes demuestran actividad dependiente de cAMP,aunquetienen una actividad basal elevada. - Los fenotipos se hicieron más severos si el fondo genético de las levaduras era RAS2;y permanecieron iguales por sobreexpresión del gen para PDE2. En la tercera parte de la tesis, y utilizando el mismo modelo de S.cerevisiae seencaró la sobreexpresión de algunas de las mutantes bcy1: construcción de losvectores correspondientes, estudio de la sobreexpresión y análisis de los fenotiposresultantes. El conjunto de estos resultados (manuscrito en preparación) confirma laconclusión que obtuviéramos en la primera parte: las holoenzimas mutadas tienenactividad enzimática. Del conjunto de los resultados genético-bioquímicos obtenidos hasta ahora enel sistema de las mutantes de levadura hemos concluido, que las holoenzimasmutadas tienen actividad fosforilante de proteinas sin necesidad de disociarse en sussubunidades, que la capacidad fosforilante de proteinas es diferente para cadamutante (diferentes fenotipos) y proponemos que los cambios conformacionalesproducidos por las mutaciones pueden ser similares a los introducidos por el cAMP alinteractuar con la holoenzima. The general aim of this thesis is to contribute to the study of the mechanism ofactivation of CAMP-dependent protein kinases (PKA). Some of the questions to solveon this field are the following: is it necessary for the holoenzyme to dissociate to beactivated by CAMP? ls cAMP the only agent that promotes activation? How do theholoenzymes select the substrate to phosphorylate? In this work we have used two lower eukaryotic models. 1) Partially purified PKA from the dimorphic fungus Mucor rouxii and in vitro assays. 2) Mutants of the regulatory subunit (bcy1) of protein kinase A from the yeast Saccharomyces cerevisiae , using a molecular-genetic-biochemical approach. Using the first model and working at holoenzyme concentrations in the range ofnM we have arrived to the following conclusions (Mechanism of activation of cAMP dependentprotein kinase. In Mucor muxii the apparent specific activity of the cAMPactivated holoenzyme is different to that of its free catalytic subunit, V.Zaremberg, A.Donnella-Deana and S.Moreno; submitted to Archives in Biochemistry and Biophysics) - under this range of enzyme concentration, the enzymatic activity using peptide assubstrates is non linear; while it is almost linear when using protamine as substrate. - the dependency of each peptide phosphorylating activity with cAMP, the degree ofinhibition by a specific peptide inhibitor, and the activation by polycations depends onthe peptide used as substrate. - in all the above mentioned assays. the relationship of the apparent specific activity ofthe holoenzyme with each peptide , is different from the one displayed by the isolatedfree catalytic subunit. These results can be explained by two posible models: a) the free catalyticsubunit is the enzymatic species that phosphorylates the substrates and the level ofproduction of free C depends on cAMP and on the protein or peptide substrate; b) athigh holoenzyme concentration, the existance of the species cAMP-bound holoenzymeis posible; this species is catalytically active and the selectivity for the substrates of thisspecies is different from the one of the free catalytic subunit. In the second model we have used spontaneous mutants on the bcy1 gene,isolated and generously provided by Dr. Kelly Tatchell. In first stage of this approach we have obtained the following results: (Analysisof the mechanism of activation of CAMP-dependent protein kinase through the study ofmutants of the yeast regulatory subunit, V.Zaremberg and S. Morenoi, Eur.J.Biochem. 237: 136-142, 1996.) - the levels of the regulatory (R) and catalytic (C) subunits of PKA in the mutated strainsis similar to the levels of the wild type strain.an approximate measurement of the affinity of the mutated R subunits for cAMPindicates that the affinity is decreased.measurement of PKA activity in the abscence and presence of CAMP in permeabilizedmutated and wild type cells indicates that the holoenzymes are dependent on CAMPand that basal activity is high. - the phenotypes were more severe when working on a wild type RAS2 background; andwere maintained alike when over expression the gene for PDE2 (CAMPphosphodiesterase). In the third part of this thesis, and using the same model of S.cerevisiae mutantstrains, we began the over expression of some of the bcy1 mutants: vector construction,analysis of the over expression and analysis of the derived phenotypes. These resultssuggest that the mutated holoenzymes are active. From the results obtained from the molecular genetic approaches, taken as awhole, we conclude that the mutated holoenzymes have catalytic phosphorylatingactivity without dissociating into its subunits; that the selectivity of substratephosphorylation for each mutated holoenzyme ¡s different (different phenotypes) andwe propose that the conformational structural changes produced by the mutatioon canbe similar to the changes promoted by cAMP upon interaction with the holoenzyme. Fil: Zaremberg, Vanina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3220_Zaremberg spa Universidad de Buenos Aires. 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