Glicosilaciones no convencionales en protozoarios

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Parte 1 El mecanismo de glicosilación de los residuos de asparagina de las proteinas es similar en todos loseucariotas: un oligosacárido preformado es transferido co-traduccionalmente a la proteína en elreticulo endoplasmático. Comienza entonces en dicha localización subcelular el procesamiento delm...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Merello, Silvana
Otros Autores:	Parodi, Armando J.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1995
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2731_Merello http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2731_Merello_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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La N-glicosilación en tripanosomatidos presenta caracteristicas especiales como la existencia demoleculas de dolicol extremadamente cortas, la incapacidad de sintetizar oligosacaridos glucosiladosunidos a dolicol-P-P, la presencia de oligosacariltransferasas que en sistemas libres de célulascatalizan la transferencia de oligosacáridos glucosilados y no glucosilados a la misma velocidad,el hecho de que ciertas especies solamente transfieran compuestos truncados (Man6GlcNAc2y Man7GlcNAc2) y, uno ó dos oligosacáridos (Man7GlcNAc2 y/o Man9GlcNAc2 simultáneamente)dependiendo del estadío de diferenciación, la adición de galactofuranosas a compuestos de altamanosa y finalmente la adición de ácido siálico a través de una trans-sialidasa y no por una enzimadependiente de CMP-siálico. En base a esto se decidió estudiar a dos tripanosomátidos con el objeto de determinar la presenciade otras caracteristicas distintivas. Por un lado se analizó a Blastocrithidia culicis, un tripanosomátido monogenético que vive en formalibre en el intestino de varias especies de mosquitos. Ese protozoario transfiere Man6GlcNAc en N-glicosilación. En el presente trabajo se encontró quelos oligosacáridos sensibles a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H, obtenidos a partir deglicoproteínas totales del parásito, contienen residuos de manosa, xilosa y ramnosa. La composiciónde alguno de ellos fue la siguiente: Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Rha1Man5GlcNAc2, Rha2Man6GlcNAc2, Xyl1Rha2Man6GlcNAc2, Xyl1Rha3Man6GlcNAc2 y Xyl2Rha3Man6GlcNAc2. En oligosacáridos resistentes a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H pero sensibles a N-glicanasa, sehalló la presencia de unidades de manosa, xilosa, ramnosa y ribosa. Por el otro lado se analizaron las glicoproteinas de Endotrypanum schaudinni, tripanósomátidodigenético que alterna su ciclo de vida entre un invertebrado y un vertebrado (perezoso). Se encontróque este parásito transfiere Man7GlcNAc2en la N-glicosilación de proteínas. Los oligosacáridossensibles a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H se identificaron como Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Rib1Man6GlcNAc2 y/o Gal1Man6GlcNAcl Man5GlcNAc2 conteniendo dos residuos de ribosa ógalactosa ó uno de cada uno, Rib1Man5GlcNAc2 y Gal1Man5GlcNAc2. Las galactosas se hallan enconfiguración furanosa. Los glicopéptidos resistentes a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H que fueron retenidos porconcanavalina A-Sepharose y eluídos con α-metilmanósido contienen residuos de manosa,galactosa y ribosa. Es importante de mencionar que es la primera vez que se describe la presencia de residuos de ribosaen glicoconjugados de eucariotas, de residuos de ramnosa en oligosacáridos unidos a asparagina yde unidades de xilosa en compuestos del tipo de alta manosa. Finalmente, la presencia degalactofuranosas habia sido descripta en varias especies monogenéticas, pero tan sólo en untripanosomátido digenético como Trypanosoma cruzi. Parte 2 En el presente trabajo se muestra, en membranas de Dictyostelium discoideum, la presenciade una actividad enzimática que transfiere N-acetilglucosamina-I-P, a partir de UDP-GlcNAc,a las proteinas en residuos de serina (UDP-GlcNAc: Ser-proteína N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa). Dicha actividad fue parcialmente purificada por cromatografia de afinidad en concanavalina A-Sepharose y por cromatografia de intercambio iónico en una columna de Mono Q. La enzima mostró una absoluta dependencia de cationes divalentes, siendo el Mn++ másefectivo que el Mgˉˉ. Posee un amplio rango de pH óptimo (6.5-9.0). El Km para el UDP-GlcNAcfite de 18 μM. En ensayos libres de células se utilizaron como sustratos exógenosapomucina y tiroglobulina nativa ó desnaturalizada, mientras que proteínas como la seroalbúmina bovina y la uteroferrina nativa o desnaturalizada no mostraron capacidad aceptorapara dicha actividad. A partir de un cultivo de células realizado en presencia de [³²P]fosfato se aislaron proteínascelulares (solubles y de membrana) y del medio de cultivo. En todas las fracciones seencontró la estructura de GlcNAc-1-P-Ser, sin embargo, la mayor proporción se halló en lasproteinas secretadas. Al someter microsomas a centrifugaciones en gradientes de sacarosa , la actividad aparecióen membranas de menor densidad al compararla con la actividad que fosforila oligosacáridosde alta manosa. Esto mostró que la actividad que fosforila residuos de serina en las proteinas (UDP-GlcNAc: Ser-proteina N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa) es diferente a la quefosforila oligosacáñdos del tipo de alta manosa unidos a las proteinas (UDP-GlcNAc:glicoproteína N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa).
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La N-glicosilación en tripanosomatidos presenta caracteristicas especiales como la existencia demoleculas de dolicol extremadamente cortas, la incapacidad de sintetizar oligosacaridos glucosiladosunidos a dolicol-P-P, la presencia de oligosacariltransferasas que en sistemas libres de célulascatalizan la transferencia de oligosacáridos glucosilados y no glucosilados a la misma velocidad,el hecho de que ciertas especies solamente transfieran compuestos truncados (Man6GlcNAc2y Man7GlcNAc2) y, uno ó dos oligosacáridos (Man7GlcNAc2 y/o Man9GlcNAc2 simultáneamente)dependiendo del estadío de diferenciación, la adición de galactofuranosas a compuestos de altamanosa y finalmente la adición de ácido siálico a través de una trans-sialidasa y no por una enzimadependiente de CMP-siálico. En base a esto se decidió estudiar a dos tripanosomátidos con el objeto de determinar la presenciade otras caracteristicas distintivas. Por un lado se analizó a Blastocrithidia culicis, un tripanosomátido monogenético que vive en formalibre en el intestino de varias especies de mosquitos. Ese protozoario transfiere Man6GlcNAc en N-glicosilación. En el presente trabajo se encontró quelos oligosacáridos sensibles a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H, obtenidos a partir deglicoproteínas totales del parásito, contienen residuos de manosa, xilosa y ramnosa. La composiciónde alguno de ellos fue la siguiente: Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Rha1Man5GlcNAc2, Rha2Man6GlcNAc2, Xyl1Rha2Man6GlcNAc2, Xyl1Rha3Man6GlcNAc2 y Xyl2Rha3Man6GlcNAc2. En oligosacáridos resistentes a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H pero sensibles a N-glicanasa, sehalló la presencia de unidades de manosa, xilosa, ramnosa y ribosa. Por el otro lado se analizaron las glicoproteinas de Endotrypanum schaudinni, tripanósomátidodigenético que alterna su ciclo de vida entre un invertebrado y un vertebrado (perezoso). Se encontróque este parásito transfiere Man7GlcNAc2en la N-glicosilación de proteínas. Los oligosacáridossensibles a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H se identificaron como Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Rib1Man6GlcNAc2 y/o Gal1Man6GlcNAcl Man5GlcNAc2 conteniendo dos residuos de ribosa ógalactosa ó uno de cada uno, Rib1Man5GlcNAc2 y Gal1Man5GlcNAc2. Las galactosas se hallan enconfiguración furanosa. Los glicopéptidos resistentes a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H que fueron retenidos porconcanavalina A-Sepharose y eluídos con α-metilmanósido contienen residuos de manosa,galactosa y ribosa. Es importante de mencionar que es la primera vez que se describe la presencia de residuos de ribosaen glicoconjugados de eucariotas, de residuos de ramnosa en oligosacáridos unidos a asparagina yde unidades de xilosa en compuestos del tipo de alta manosa. Finalmente, la presencia degalactofuranosas habia sido descripta en varias especies monogenéticas, pero tan sólo en untripanosomátido digenético como Trypanosoma cruzi. Parte 2 En el presente trabajo se muestra, en membranas de Dictyostelium discoideum, la presenciade una actividad enzimática que transfiere N-acetilglucosamina-I-P, a partir de UDP-GlcNAc,a las proteinas en residuos de serina (UDP-GlcNAc: Ser-proteína N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa). Dicha actividad fue parcialmente purificada por cromatografia de afinidad en concanavalina A-Sepharose y por cromatografia de intercambio iónico en una columna de Mono Q. La enzima mostró una absoluta dependencia de cationes divalentes, siendo el Mn++ másefectivo que el Mgˉˉ. Posee un amplio rango de pH óptimo (6.5-9.0). El Km para el UDP-GlcNAcfite de 18 μM. En ensayos libres de células se utilizaron como sustratos exógenosapomucina y tiroglobulina nativa ó desnaturalizada, mientras que proteínas como la seroalbúmina bovina y la uteroferrina nativa o desnaturalizada no mostraron capacidad aceptorapara dicha actividad. A partir de un cultivo de células realizado en presencia de [³²P]fosfato se aislaron proteínascelulares (solubles y de membrana) y del medio de cultivo. En todas las fracciones seencontró la estructura de GlcNAc-1-P-Ser, sin embargo, la mayor proporción se halló en lasproteinas secretadas. Al someter microsomas a centrifugaciones en gradientes de sacarosa , la actividad aparecióen membranas de menor densidad al compararla con la actividad que fosforila oligosacáridosde alta manosa. Esto mostró que la actividad que fosforila residuos de serina en las proteinas (UDP-GlcNAc: Ser-proteina N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa) es diferente a la quefosforila oligosacáñdos del tipo de alta manosa unidos a las proteinas (UDP-GlcNAc:glicoproteína N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa). Fil: Merello, Silvana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2731_Merello spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar Glicosilaciones no convencionales en protozoarios info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2731_Merello_oai

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