Glicoinositolfosfolípidos de Trypanosoma cruzi (epimastigote)

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El objetiVo de la presente Tesis fue la purificación,identificación y caracterización de glicoinositolfosfolípidos deformas epimastigote de Trypanosoma cruzi, cepa Y. Uno de ellos, el lipopéptidofosfoglicano (LPPG) es unaglicoinositolfosfoceramida, cuya estructura parcial ya habiasido determinada po...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Ramírez, María Isabel
Otros Autores: Muchnik de Lederkremer, Rosa María
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1992
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2477_Ramirez
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2477_Ramirez_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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El LPPG A, que es un glicoinositolfosfolipido que poseealquilglicerol y el LPPG B que es una glicoinositolfosfoceramida. Se presentan en esta Tesis: 1. Una reseña acerca de las principales caracteristicas de losglicoinositolfosfolipidos (GIPLs). El mecanismo de anclaje demacromoléculas a la membrana plasmática a través de GIPL se hadescripto a lo largo de la última década. Son muchas lasproteinas en las que se detectó este tipo de unión covalente,pero sólo se sabe hasta el momento la estructura completa detres anclas glicolipidicas. 2. Un resumen de las caracteristicas morfológicas y biológicasde nuestro sistema. experimental: el .Trypanosoma cruzi, agentecausante de la enfermedad de Chagas. 3. Una actualización de los estudios realizados sobre losdiferentes glicoconjugados de membranadel T. cruzi. 4. Un detalle de los resultados previos obtenidos sobre el LPPGpor nuestro grupo de trabajo y los grupos de Ferguson y Previato. 5. Los resultados obtenidos a lo largo de esta Tesis. Los mismosse dividen en dos partes: A- La determinación de la estructura completa del glicano del LPPG. B- El estudio de los glicoinositolfosfolipidos en células delsegundo dia de cultivo de formas epimastigote de T. cruzi,cepa Y. Estos Capitulos incluyen: A a) La purificación del LPPG. b) La liberación de la fracción lipidica por acción de la enzima PI-PLC y por métodos quimicos. c) El análisis del glicano del LPPG por métodos enzimáticos ypor análisis de metilación. d) El estudio espectroscópico de distintos productos dehidrólisis obtenidos a partir del LPPG. e) La determinación de la presencia de CRD sobre el LPPG tratadocon PI-PLC. B f) La purificación y separación de dos glicoinositolfosfolipidosde células de T. cruzi del segundo dia de cultivo (LPPG A y B). h) La determinación de la estructura lipidica de los LPPGA y B. i) El análisis estructural del glicano constituyente de losmismos: composición de azúcares, análisis de metilación ydeterminación de la configuración de la galactosa. j) Determinación de aminoácidos y ácidos aminofosfónicospresentes en ambos compuestos. A a) Purificación del LPPG. Se modificó el esquema depurificación utilizado por Lederkremer y col.(236),introduciendo un paso de extracción con agua saturada enn-butanol (297) y un último paso de purificación porcromatografía de hidrofobicidad en columna de Octyl-Sepharose,obteniendose el LPPG homogeneo. b) Liberación de la fraccion lipidica del LPPG. Acciónde la enzima PI-PLC. La enzima fosfatidilinositolfosfolipasa C cliva especificamente la unión inositol-fosfato-lipido englicoinositolfosfolipidos, obteniéndose el glicoinositolfosfato 1,2 cíclico. Esta reacción se ha utilizado como herramienta paraidentificar anclas glicolipidicas (17). La acción de ésta enzimasobre el LPPG liberó la ceramida del glicano indicando que el LPPG posee una estructura análoga a las anclas estudiadas hastael momento. La unión fosfato entre el inositol y el lipidoresultó labil a la hidrólisis con HF 50% y con NaOH 1 M o KOH 0,25 M en metanol. c) Análisis del glicano del LPPG. La reacción dedesaminación con HNO2 es una reacción caracteristica de lasanclas glicolipidicas ya que las mismas poseen glucosamina sinacilar, unida al inositol (28). La obtención de oligosacáridoscon 2,5-anhidromanitol en su extremo reductor luego deltratamiento del LPPG con HNO; y reducción con NaBH4 nos indicóla presencia de glucosamina sin acilar en el mismo. Estosoligosacáridos poseen 1 ó 2 galactosas terminales enconfiguración furanósica, unidas fi(1-3) a dos Man-α(1-2). Lasmismas fueron determinadas en el estudio de metilación. Eltratamiento de los oligosacáridos con α-manosidasas de distintaespecificidad, luego de hidrolizar las galactosas, indicó quelos mismos poseen una cadena de α-Man formada por 3 ó 4unidades. Por el estudio de metilación de determinaron, ademásde las dos manosas unidas (1-2), una tercera unida (1-6) y lamanosa unida a la glucosamina en posición 4. Se determinótambién que la GlcNH2 se une a la posición 6 del inositol. d) Estudio espectroscópico del LPPG. Por 31P-RMN sedeterminó la presencia de la unión fosfonato correspondiente alácido 2-aminoetilfosfónico. Por el análisis de metilaciónhabiamos determinado que el mismo se une al HO-6 de laglucosamina. La formación del fosfato 1,2-ciclico sobre elinositol luego de la acción de la enzima PI-PLC fue puesta demanifiesto en estos espectros. En el análisis del 1H-RMN se determinó que la Gal se une β(1—3)a las Man-α(l-2), que la glucosamina está en configuración α,corroborándose también los datos obtenidos en el estudio dedegradación con α-manosidasas y de metilación. El análisis por FAB-MS de los glicanos del LPPG mostró lamicroheterogeneidad existente por la diferente sustitución porlas galactosas y por el número de manosas. Se observó también laramificación en la posición H0-3 de la penúltima manosa por Galf. e) Análisis del determinante de reactividad cruzada. Altratar las anclas glicolipidicas con PI-PLCse expone un epitopellamado CRD o determinante de reactividad cruzada (98). El mismose localiza sobre el glicano de las anclas y son los epitopesreconocidos en todas las glicoproteinas con ancla glicolipidica. Esta reacción se utiliza como criterio de reconocimiento deproteinas ancladas a membranapor GPI. El CRD se detectó sobreel LPPG por ensayo de ELISA luego del tratamiento con PI-PLC,indicando que éstas moléculas poseen una estructura análoga alas anclas de glicoproteinas a membranas. B f) Purificación de otros glicoinositolfosfolipidos . Utilizando el mismo esquema de purificación del LPPG seobtuvieron, en células epimastigote del segundo dia de cultivo,dos glicoinositolfosfolipidos en cantidades equiparables. Losmismos se separaron en columna de Octyl-Sepharose. Por SDS-PAGEambos compuestos mostraron un peso molecular semejante entre 7000-12000 Da. g) Estructura lípidica de los LPPGA y B. Los lípidos deambos compuestos se liberaron con PI-PLC de Bacillusthuringiensis. y Bacillurens, indicando una estructuraanáloga a los GIPL. Por análisis por c.c.d. y por cgl-em sedeterminó que el LPPGA posee 1-0-hexadecilglicerol parcialmenteacilado con ácido palmitico y el LPPG B posee una ceramidaformada principalmente por C18-esfinganina y ácidos palmitico ylignocérico, es decir es semejante al aislado de células decuatro dias de cultivo. h) Análisis del glicano de los LPPG A y B. Se determinóque en ambos compuestos los azúcares principales eran manosa ygalactosa en una relación aproximada de 2,7/1. La glucosaminapresente se encuentra unida al inositol y posee AEP unido a unode sus OH. La galactosa presente se encuentra terminal y en sumayor parte furanósica, pero a diferencia del LPPG del cuartodia de cultivo también se determinó una cierta proporción degalactosa piranósica. Según el ensayo de metilación, las manosasse encuentran principalmente involucradas en uniones (1-2) y (1-6) y las galactosas sustituyen los H0-3 de las manosas unidas (1-2) ya que se determinó la presencia de 4,6-di-O-metil-manosa. A diferencia del LPPGn de células del cuarto dia de cultivo los LPPG A y B poseen manosa terminal, por lo que no todas lascadenas se encontrarian sustituidas por galactosas. j) Análisis de aminoácidos y ácidos aminofosfónicos. Sedeterminó en ambos compuestos la presencia de ácido 2-aminoetilfosfónico luego de la hidrólisis con HCl 6 M, 24 h a 100°c. El LPPGA posee un porcentaje mayor de aminoácidos ácidos, comoel glutámico y el aspártico, que aminoácidos hidroxilados. En el LPPGB esta relación se invierte al igual que en el LPPG decélulas del cuarto dia de cultivo. En el LPPGA el 100% de losaminoácidos son saponificables, mientras que en el LPPGB sóloel 66% de los mismos se liberan en condiciones desaponificación. Todos estos resultados nos permitieron determinar que lasformas epimastigote de T. cruzi poseen estructuras análogas a losanclas de glicoproteinas a membranas y que las mismas varian ensu estructura dependiendo del tiempo de crecimiento de loscultivos. Esta variabilidad se deberia a que los mismos podrianunirse a glicoproteinas en forma selectiva o remodelar suslípidos a medida que avanza el tiempo de crecimiento y se llegaal estado estacionario, detectándose sólo laglicoinositolfosfoceramida en los cultivos de mayor tiempo.
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Por extracción de células del segundo día de cultivo, eniguales condiciones en las que se extrajo el LPPG,se detectarondos glicoinositolfosfolipidos en cantidades equiparables. El LPPG A, que es un glicoinositolfosfolipido que poseealquilglicerol y el LPPG B que es una glicoinositolfosfoceramida. Se presentan en esta Tesis: 1. Una reseña acerca de las principales caracteristicas de losglicoinositolfosfolipidos (GIPLs). El mecanismo de anclaje demacromoléculas a la membrana plasmática a través de GIPL se hadescripto a lo largo de la última década. Son muchas lasproteinas en las que se detectó este tipo de unión covalente,pero sólo se sabe hasta el momento la estructura completa detres anclas glicolipidicas. 2. Un resumen de las caracteristicas morfológicas y biológicasde nuestro sistema. experimental: el .Trypanosoma cruzi, agentecausante de la enfermedad de Chagas. 3. Una actualización de los estudios realizados sobre losdiferentes glicoconjugados de membranadel T. cruzi. 4. Un detalle de los resultados previos obtenidos sobre el LPPGpor nuestro grupo de trabajo y los grupos de Ferguson y Previato. 5. Los resultados obtenidos a lo largo de esta Tesis. Los mismosse dividen en dos partes: A- La determinación de la estructura completa del glicano del LPPG. B- El estudio de los glicoinositolfosfolipidos en células delsegundo dia de cultivo de formas epimastigote de T. cruzi,cepa Y. Estos Capitulos incluyen: A a) La purificación del LPPG. b) La liberación de la fracción lipidica por acción de la enzima PI-PLC y por métodos quimicos. c) El análisis del glicano del LPPG por métodos enzimáticos ypor análisis de metilación. d) El estudio espectroscópico de distintos productos dehidrólisis obtenidos a partir del LPPG. e) La determinación de la presencia de CRD sobre el LPPG tratadocon PI-PLC. B f) La purificación y separación de dos glicoinositolfosfolipidosde células de T. cruzi del segundo dia de cultivo (LPPG A y B). h) La determinación de la estructura lipidica de los LPPGA y B. i) El análisis estructural del glicano constituyente de losmismos: composición de azúcares, análisis de metilación ydeterminación de la configuración de la galactosa. j) Determinación de aminoácidos y ácidos aminofosfónicospresentes en ambos compuestos. A a) Purificación del LPPG. Se modificó el esquema depurificación utilizado por Lederkremer y col.(236),introduciendo un paso de extracción con agua saturada enn-butanol (297) y un último paso de purificación porcromatografía de hidrofobicidad en columna de Octyl-Sepharose,obteniendose el LPPG homogeneo. b) Liberación de la fraccion lipidica del LPPG. Acciónde la enzima PI-PLC. La enzima fosfatidilinositolfosfolipasa C cliva especificamente la unión inositol-fosfato-lipido englicoinositolfosfolipidos, obteniéndose el glicoinositolfosfato 1,2 cíclico. Esta reacción se ha utilizado como herramienta paraidentificar anclas glicolipidicas (17). La acción de ésta enzimasobre el LPPG liberó la ceramida del glicano indicando que el LPPG posee una estructura análoga a las anclas estudiadas hastael momento. La unión fosfato entre el inositol y el lipidoresultó labil a la hidrólisis con HF 50% y con NaOH 1 M o KOH 0,25 M en metanol. c) Análisis del glicano del LPPG. La reacción dedesaminación con HNO2 es una reacción caracteristica de lasanclas glicolipidicas ya que las mismas poseen glucosamina sinacilar, unida al inositol (28). La obtención de oligosacáridoscon 2,5-anhidromanitol en su extremo reductor luego deltratamiento del LPPG con HNO; y reducción con NaBH4 nos indicóla presencia de glucosamina sin acilar en el mismo. Estosoligosacáridos poseen 1 ó 2 galactosas terminales enconfiguración furanósica, unidas fi(1-3) a dos Man-α(1-2). Lasmismas fueron determinadas en el estudio de metilación. Eltratamiento de los oligosacáridos con α-manosidasas de distintaespecificidad, luego de hidrolizar las galactosas, indicó quelos mismos poseen una cadena de α-Man formada por 3 ó 4unidades. Por el estudio de metilación de determinaron, ademásde las dos manosas unidas (1-2), una tercera unida (1-6) y lamanosa unida a la glucosamina en posición 4. Se determinótambién que la GlcNH2 se une a la posición 6 del inositol. d) Estudio espectroscópico del LPPG. Por 31P-RMN sedeterminó la presencia de la unión fosfonato correspondiente alácido 2-aminoetilfosfónico. Por el análisis de metilaciónhabiamos determinado que el mismo se une al HO-6 de laglucosamina. La formación del fosfato 1,2-ciclico sobre elinositol luego de la acción de la enzima PI-PLC fue puesta demanifiesto en estos espectros. En el análisis del 1H-RMN se determinó que la Gal se une β(1—3)a las Man-α(l-2), que la glucosamina está en configuración α,corroborándose también los datos obtenidos en el estudio dedegradación con α-manosidasas y de metilación. El análisis por FAB-MS de los glicanos del LPPG mostró lamicroheterogeneidad existente por la diferente sustitución porlas galactosas y por el número de manosas. Se observó también laramificación en la posición H0-3 de la penúltima manosa por Galf. e) Análisis del determinante de reactividad cruzada. Altratar las anclas glicolipidicas con PI-PLCse expone un epitopellamado CRD o determinante de reactividad cruzada (98). El mismose localiza sobre el glicano de las anclas y son los epitopesreconocidos en todas las glicoproteinas con ancla glicolipidica. Esta reacción se utiliza como criterio de reconocimiento deproteinas ancladas a membranapor GPI. El CRD se detectó sobreel LPPG por ensayo de ELISA luego del tratamiento con PI-PLC,indicando que éstas moléculas poseen una estructura análoga alas anclas de glicoproteinas a membranas. B f) Purificación de otros glicoinositolfosfolipidos . Utilizando el mismo esquema de purificación del LPPG seobtuvieron, en células epimastigote del segundo dia de cultivo,dos glicoinositolfosfolipidos en cantidades equiparables. Losmismos se separaron en columna de Octyl-Sepharose. Por SDS-PAGEambos compuestos mostraron un peso molecular semejante entre 7000-12000 Da. g) Estructura lípidica de los LPPGA y B. Los lípidos deambos compuestos se liberaron con PI-PLC de Bacillusthuringiensis. y Bacillurens, indicando una estructuraanáloga a los GIPL. Por análisis por c.c.d. y por cgl-em sedeterminó que el LPPGA posee 1-0-hexadecilglicerol parcialmenteacilado con ácido palmitico y el LPPG B posee una ceramidaformada principalmente por C18-esfinganina y ácidos palmitico ylignocérico, es decir es semejante al aislado de células decuatro dias de cultivo. h) Análisis del glicano de los LPPG A y B. Se determinóque en ambos compuestos los azúcares principales eran manosa ygalactosa en una relación aproximada de 2,7/1. La glucosaminapresente se encuentra unida al inositol y posee AEP unido a unode sus OH. La galactosa presente se encuentra terminal y en sumayor parte furanósica, pero a diferencia del LPPG del cuartodia de cultivo también se determinó una cierta proporción degalactosa piranósica. Según el ensayo de metilación, las manosasse encuentran principalmente involucradas en uniones (1-2) y (1-6) y las galactosas sustituyen los H0-3 de las manosas unidas (1-2) ya que se determinó la presencia de 4,6-di-O-metil-manosa. A diferencia del LPPGn de células del cuarto dia de cultivo los LPPG A y B poseen manosa terminal, por lo que no todas lascadenas se encontrarian sustituidas por galactosas. j) Análisis de aminoácidos y ácidos aminofosfónicos. Sedeterminó en ambos compuestos la presencia de ácido 2-aminoetilfosfónico luego de la hidrólisis con HCl 6 M, 24 h a 100°c. El LPPGA posee un porcentaje mayor de aminoácidos ácidos, comoel glutámico y el aspártico, que aminoácidos hidroxilados. En el LPPGB esta relación se invierte al igual que en el LPPG decélulas del cuarto dia de cultivo. En el LPPGA el 100% de losaminoácidos son saponificables, mientras que en el LPPGB sóloel 66% de los mismos se liberan en condiciones desaponificación. Todos estos resultados nos permitieron determinar que lasformas epimastigote de T. cruzi poseen estructuras análogas a losanclas de glicoproteinas a membranas y que las mismas varian ensu estructura dependiendo del tiempo de crecimiento de loscultivos. Esta variabilidad se deberia a que los mismos podrianunirse a glicoproteinas en forma selectiva o remodelar suslípidos a medida que avanza el tiempo de crecimiento y se llegaal estado estacionario, detectándose sólo laglicoinositolfosfoceramida en los cultivos de mayor tiempo. Fil: Ramírez, María Isabel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2477_Ramirez spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar Glicoinositolfosfolípidos de Trypanosoma cruzi (epimastigote) info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2477_Ramirez_oai

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