Producción mitocondrial de anión superóxido y su efecto biológico

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La adición de NADH a partículas submitocondriales de corazón bovino incubadas con rotenona, antimicina o cianuro estimula la producción de anión superóxido. La generación de anión superóxido en el area ubiquinona-citocromo b de la cadena respiratoria es fuértemente inhibida por el agregado de cianur...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Turrens, Julio Francisco
Otros Autores: Boveris, Alberto
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1980
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1634_Turrens
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n1634_Turrens_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La adición de NADH a partículas submitocondriales de corazón bovino incubadas con rotenona, antimicina o cianuro estimula la producción de anión superóxido. La generación de anión superóxido en el area ubiquinona-citocromo b de la cadena respiratoria es fuértemente inhibida por el agregado de cianuro (Boveris,l977). Por lo tanto, la actividad en presencia de cianuro demuestra que en la cadena respiratoria existe otro sitio capaz de producir anión superóxido, permitiendo además medir la producción en este sitio sin interferencias. La presencia de adrenalina y NADH origina una reacción autocatalítica, catalizada por las partículas submitocondriales. El peróxido de hidrógeno es un intermediario en este proceso. Se estudió la producción de anión superóxido en el area NADH deshidrogenasa midiendo la formación de adrenocromo inhibiblepor Mn-superóxido dismutasa al incubar partículas submitocondriales con succinato, cianuro y ATP. En estas condiciones los electrones provenientes de la oxidación del succinato a fumarato circulan por la cadena respiratoria en sentido inverso, es decir, desde la ubiquinona a la NADH deshidrogenasa. Se encontró una actividad constante de 0.8 a 1 nmol / min . mg de proteína a pH 7.4. La actividad es sensible al agregado de rotenona, lo que demuestra que la producción de anión superóxido se realiza del lado sustrato del sitio de acción del inhibidor. La dependencia de esta actividad con la energía hace que sea inhibible por oligomicina (inhibidor de la ATPasa) y por el desacoplante FCCP. Los títulos de inhibición para rotenona, oligomicina y FCCP (0.25 nmol/mg de prot., D.0 nmol/mg de prot y 0.3 μM) son similares a los encontrados para la inhibición de la actividad de succinato-NAD reductasa (0.3 nmol/mg de prot, 0.8 nmol/mg de prot y 0.2 μM). Se concluye que ambas actividades requieren la intervención del flujo invertido de electrones en igual magnitud. Las mediciones realizadas determinando la reducción de citocromoc acetilado para la detección del anión superóxido, en presencia de NADH y rotenona, permitieron obtener valores similares para la actividad productora de anión superóxido en el area NADH deshidrogenasa. El agregado de cantidades crecientes de rotenona a partículas submitocondriales incubadas con NADH y antimicina presenta una respuesta bifásica. Bajas concentraciones de rotenona estimulan la producción de anión superóxido al producir probablemente un aumento en el grado de reducción de la flavoproteína sin inhibir totalmente el flujo de electrones hacia el segmento ubiquinona-citocromo b. El aumento de la concentración de rotenona impide la reducción de la quinona inhibiendola actividad inicial en un 60%. La actividad observada en el area NADH deshidrogenasa tiene un valor cercano al 50% de la actividad determinada en el area ubiquinona-citocromo b. La producción de anión superóxido determinada independientemente en ambos sitios es aditiva entre pH 7 y 8.2. El efecto de la producción de este radical se estudió en la forma epimastigote del Trypanosoma cruzi, ya que estas células carecen de catalasa. Los experimentos realizados demuestran que no hay actividad de glutation peroxidasa dependiente de Se ni peroxidasas que utilicen dadores artificiales de hidrógeno tales como guayacol pirogalel, diaminobencidina y citocromo c. Se observó una débil actividad peroxidática dependiente de ascorbato resistente al calor, por lo que se sospecha que no es enzimática. La concentración de superóxido dismutasa (68 mU/10^8 células) es alrededor de 1/20 de la actividad observada en hepatocitos. Las deficiencias observadas en el sistema encargado delmetabolismo de los intermediarios de la reducción parcial del oxígeno permite estudiar el efecto de drogas que estimulen la producción de estos compuestos. Se estudió la producción de anión superóxido y peróxido de hidrógeno desencadenada por el agregado de la quinona β-lapachona, ensayándose el efecto producido por el isómero biológicamente inactivo, α-lapachona. Esta última no tuvo actividad sobre epimastigotes enteros ni sobre fracciones subcelulares. El agregado de β-lapachona sobre células enteras estimula la liberación de peróxido de hidrógeno y anión superóxido. La adición de esta quinona sobre homogenados mostró mayor actividad cuando se utilizó NADH como reductor que al utilizar NADPH. La fracción mitocondrial (40% de proteína inicial) incrementóla producción de anión superóxido y peróxido de hidrógeno 4.5 y 2.5 veces respectivamente por el agregado de β-lapachona al sistema incubado con NADH. El efecto sobre la fracción microsomal fue notable pero menos importante que sobre la fracción mitocondrial. En este caso la actividad depende del agregado de NADPH como reductor, aumentando la producción de intermediarios de la reducción parcial del oxígeno alrededor de dos veces. Dada la hidrofobicidad de las quinonas, y la especificidad de sustrato para la reducción parcial del oxígeno se puede concluir que las membranas mitocondriales son responsables del 92% del peróxido de hidrógeno formado por los epimastigotes de Tripanosoma cruzi. Las deficiencias en el metabolismo de intermediarios de la reducción parcial del oxígeno y, por otra parte, la presencia de esteroles 5,7-diénicos cuya síntesis es activa en el Trypanosoma cruzi, proveen dos blancos excelentes para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, causada por este hemoparásito.
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Se estudió la producción de anión superóxido en el area NADH deshidrogenasa midiendo la formación de adrenocromo inhibiblepor Mn-superóxido dismutasa al incubar partículas submitocondriales con succinato, cianuro y ATP. En estas condiciones los electrones provenientes de la oxidación del succinato a fumarato circulan por la cadena respiratoria en sentido inverso, es decir, desde la ubiquinona a la NADH deshidrogenasa. Se encontró una actividad constante de 0.8 a 1 nmol / min . mg de proteína a pH 7.4. La actividad es sensible al agregado de rotenona, lo que demuestra que la producción de anión superóxido se realiza del lado sustrato del sitio de acción del inhibidor. La dependencia de esta actividad con la energía hace que sea inhibible por oligomicina (inhibidor de la ATPasa) y por el desacoplante FCCP. Los títulos de inhibición para rotenona, oligomicina y FCCP (0.25 nmol/mg de prot., D.0 nmol/mg de prot y 0.3 μM) son similares a los encontrados para la inhibición de la actividad de succinato-NAD reductasa (0.3 nmol/mg de prot, 0.8 nmol/mg de prot y 0.2 μM). Se concluye que ambas actividades requieren la intervención del flujo invertido de electrones en igual magnitud. Las mediciones realizadas determinando la reducción de citocromoc acetilado para la detección del anión superóxido, en presencia de NADH y rotenona, permitieron obtener valores similares para la actividad productora de anión superóxido en el area NADH deshidrogenasa. El agregado de cantidades crecientes de rotenona a partículas submitocondriales incubadas con NADH y antimicina presenta una respuesta bifásica. Bajas concentraciones de rotenona estimulan la producción de anión superóxido al producir probablemente un aumento en el grado de reducción de la flavoproteína sin inhibir totalmente el flujo de electrones hacia el segmento ubiquinona-citocromo b. El aumento de la concentración de rotenona impide la reducción de la quinona inhibiendola actividad inicial en un 60%. La actividad observada en el area NADH deshidrogenasa tiene un valor cercano al 50% de la actividad determinada en el area ubiquinona-citocromo b. La producción de anión superóxido determinada independientemente en ambos sitios es aditiva entre pH 7 y 8.2. El efecto de la producción de este radical se estudió en la forma epimastigote del Trypanosoma cruzi, ya que estas células carecen de catalasa. Los experimentos realizados demuestran que no hay actividad de glutation peroxidasa dependiente de Se ni peroxidasas que utilicen dadores artificiales de hidrógeno tales como guayacol pirogalel, diaminobencidina y citocromo c. Se observó una débil actividad peroxidática dependiente de ascorbato resistente al calor, por lo que se sospecha que no es enzimática. La concentración de superóxido dismutasa (68 mU/10^8 células) es alrededor de 1/20 de la actividad observada en hepatocitos. Las deficiencias observadas en el sistema encargado delmetabolismo de los intermediarios de la reducción parcial del oxígeno permite estudiar el efecto de drogas que estimulen la producción de estos compuestos. Se estudió la producción de anión superóxido y peróxido de hidrógeno desencadenada por el agregado de la quinona β-lapachona, ensayándose el efecto producido por el isómero biológicamente inactivo, α-lapachona. Esta última no tuvo actividad sobre epimastigotes enteros ni sobre fracciones subcelulares. El agregado de β-lapachona sobre células enteras estimula la liberación de peróxido de hidrógeno y anión superóxido. La adición de esta quinona sobre homogenados mostró mayor actividad cuando se utilizó NADH como reductor que al utilizar NADPH. La fracción mitocondrial (40% de proteína inicial) incrementóla producción de anión superóxido y peróxido de hidrógeno 4.5 y 2.5 veces respectivamente por el agregado de β-lapachona al sistema incubado con NADH. El efecto sobre la fracción microsomal fue notable pero menos importante que sobre la fracción mitocondrial. En este caso la actividad depende del agregado de NADPH como reductor, aumentando la producción de intermediarios de la reducción parcial del oxígeno alrededor de dos veces. Dada la hidrofobicidad de las quinonas, y la especificidad de sustrato para la reducción parcial del oxígeno se puede concluir que las membranas mitocondriales son responsables del 92% del peróxido de hidrógeno formado por los epimastigotes de Tripanosoma cruzi. Las deficiencias en el metabolismo de intermediarios de la reducción parcial del oxígeno y, por otra parte, la presencia de esteroles 5,7-diénicos cuya síntesis es activa en el Trypanosoma cruzi, proveen dos blancos excelentes para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, causada por este hemoparásito. Fil: Turrens, Julio Francisco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1634_Turrens spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar Producción mitocondrial de anión superóxido y su efecto biológico info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n1634_Turrens_oai

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